ErbB2致癌基因在条件表达中能引起转基因小鼠复层上皮可逆性增长和TGFα表达量上升外文翻译资料

ErbB2致癌基因在条件表达中能引起转基因小鼠复层上皮可逆性增长和TGFalpha;表达量上升

原文作者 Wen xie,Louise T Chow,Andrew J Paterson,Edward Chin,Jeffrey E Kudlow--

摘要：ErbB2受体酪氨酸激酶（RTK）被表达在鳞状上皮细胞的基底细胞和毛囊外根鞘中。我们之前表明激活的ErbB2基本表达指向转基因小鼠皮肤角蛋白14（K14）启动子产生明显的毛囊异常与角质增生。然而孕产期死亡率排除建立在转基因株系分析ErbB2功能的成年动物。为了研究ErbB2信号在上皮组织 的传导及后期发展的意义，建立了 K14-rtTA/TetRE-ErbB2 `Tet-Onrsquo;少量转基因小鼠系统。这些小鼠均正常，一直到转基因ErbB2通过诱导暴露在多西环素（强力霉素）中。孕产期诱发幼鼠0死亡。出生后ErbB2转基因表达在DOX作用后4小时被观察到，24小时之内到达平台期。在注射后2天内皮肤增生，DOX停药后这些变化恢复到正常。在成年动物中与幼鼠一样，延长ErbB2的诱导造成皮肤突出和毛囊增生。能够观察到重度增生发生在角膜，眼睑，舌和食道。ErbB2转基因诱导伴随着 TGFa的表达，表皮生长因子受体(EGFR）在较小的程度上能进一步提高RTK信号转导。我们的结论是ErbB2的两个发展在维护毛囊，多样化的鳞状上皮和该配体诱导组织特意lsquo;Tet-Onrsquo;转基因小鼠系统提供了一种手段，用来研究转基因和孕产期毒性。

关键词: 四环素；皮肤；毛囊。

前言

表皮生长因子受体(EGFR）属于一个受体酪氨酸激酶(RTK)超家族,其中包括ErbB2，ErbB3和ErbB4（综述见Carraway and Cantley, 1994; Dougallet al., 1994）。表皮生长因子受体及其配体EGF和 TGFa已被证明在皮肤与毛囊生长中起着重要作用（Vassar and Fuchs, 1991; Luetteke etal., 1993; Mann et al., 1993; Miettinen et al., 1995;Murillaset al., 1995; Sibilia and Wagner, 1995;Threadgillet al., 1995; Wang et al., 1994; Xie et al.,1998)。越来越多的证据表明ErbB家族各成员在细胞调节中发挥互相合作的功能 (综述见Carraway and Cantley, 1994;Dougallet al., 1994)。大鼠c-neu/erbB2的基因编码一条185KDa的在表皮生长因子受体(Bargmannet al., 1986)上的跨膜糖蛋白Padhyet al.,1982)并且具有相当的序列同源性，但其配体不能明确的识别。内源性的ErbB2基因在表皮(Kokaietal., 1987) 的基底细胞与毛囊（Maguire et al., 1989）的外根鞘（ORS）中表达出来。ErbB2的表达水平在幼体组织中较高与成年体组织(Press et al., 1990)，这提示在ErbB2信号在皮肤和毛囊发育起的作用。描述ErbB2在皮肤发育起的作用，我们之前构建的转基因小鼠能够在人角蛋白14(K14）启动子(Xieet al., 1998)调控下激活皮肤中的ErbB2表达。这策略指导增加ErbB2信号在细胞正常表达中。所有的K14-ErbB2转基因小鼠都表现出明显的毛囊形态破坏。大多数毛囊取而代之出现的是过度增殖性皮内鳞状内陷，而剩下的毛囊表现出严重的增生和组织损坏。这些观察结果表明RTK在表皮生长，分化和毛囊形态起着重要作用。然而所有转基因小鼠中的一只在出生前或出生后不久死亡，可能是因为皮肤和食道存在缺陷的结果。因此没有建立在ErbB2维持成年体动物表皮毛囊功能详细分析的转基因小鼠系是不被允许的。

在这份报告中，我们描述的lsquo;Tet-Onrsquo;转基因小鼠系统（(Furthet al., 1994;Kistneret al., 1996), 其中在表皮细胞与其他皮层中激活的ErbB2只有在幼体在子宫内或出生后经DOX影响才能诱导上皮细胞表达。转基因在相对较短的持续时间内是迅速与可逆的。更长时间诱导激活的ErbB2会在各种上皮组织中如皮肤，角膜，舌和食道中出现明显增生。这些动物很快就死了，可能是由于无法摄取食物。有趣的是TGFalpha;和EGFR也上调，进一步增强的RTK信号。我们的研究结果表明，在我们之前的K14-ErbB2的模型，表明ErbB2在毛囊的形态差异与表皮是重要的，但ErbB2的信号可能还保护分层上皮细胞。

结果

转基因小鼠的产生

两个株系的转基因小鼠产生：一转基因系（K14-rtTA）受到2.3KDa人角蛋白启动子的影响表达了相反的四环素敏感转录激活物（rtTA）(Xieet al., 1998);另一转基因系(TetRE-ErbB2）编码并在最小启动子与四环素的控制下激活ErbB2的小鼠(Shihet al., 1981)。总共发现五只K14-rtTA阳性转基因小鼠，和四只TetRE-ErbB2阳性转基因小鼠，用一对引物通过PCR的手段分别进行K14-rtTA 与 TetRE-ErbB2基因型鉴定。转基因的完整性通过Southern印迹分析证实（图1），对常见的转基因SV40序列使用特异性基因探针。初始

筛选证实rtTA mRNA在表皮的K14 rtTA线3-8中表达，使用皮肤RNA通过RT PCR判断（数据未显示）。K14 -rtTA线3-8和TetRe-erbB2线8-4中使用大量的杂交实验产生双基因

动物。获得类似的结果时，另TetRe-erbB2线（线1-1）进行杂交（数据未显示）。rtTA预计在K14的指导下鳞状上皮基底细胞和毛囊外根鞘发生独特的变形(Xie et al., 1998).我们还预计rtTA通过在组织特异性的方式表达，只在所处DOX（Tet）才能结合TetRe，具体归纳通过编码激活的ErbB2进行转基因表达。

图一 Tet-On诱导转基因小鼠系统和转基因小鼠的Southern blot分析。 （a）示意图 K14-rtTA / TetRE-ErbB2的双组分Tet-On-转基因小鼠系统。 在K14-rtTA转基因指导下反向四环素转录激活物（rtTA）分泌到表皮。 rtTA的四环素反应元件结合 （TetRE）和转基因ErbB2只有存在多西环素（DOX）的诱导下才发生。（b和c）Southern印迹 能分别分析TetRE-ErbB2和K14-rtTA转基因小鼠。从每一只转基因小鼠活体尾部提取的 基因组DNA （分别为TG3-8的K14-rtTA，或TG8-4的TetRE-ErbB2）或它们的非转基因对照 经消化用 Sal I，并进行Southern印迹分析。每个已切除100pg的转基因片段的原始含转基因的质粒被装载作为阳性对照。 过滤探测到 ³² P标记的SV40 SalI-EcoRI外源性特意基因片段。

皮肤异常，失明，极度瘦弱，和通过多西环素延长诱导引起的过早死亡

不同于以往的K14-ErbB2的转基因小鼠中，双转基因在缺乏DOX管理期间怀孕，没有异常现象表明，他们的窝中单一的转基因，或没有转基因，在各阶段的发展（图2，而数据未示出）。然而，在孕产管理DOX开始到中晚妊娠后期（10plusmn;18 d.p.c）导致了约50％以内的双转基因新生儿死产率。 所有的出生双转基因在24小时内死亡和一感染动物表现出增厚的苍白皮肤，但没有明显的皮肤皱纹（数据未显示）。这些皮肤特征和孕产期幼体死亡的现象与那些在k14-ErbB2转基因小鼠中观察到的相同(Xieet al., 1998)。新生幼体表现出运动障碍和不能哺乳或许进一步只是孕产期幼体死亡。

出生后在哺乳期或断奶后在DOX的作用下会引起明显的皮肤表观变化。从第2天或第3经 Dox诱导后，其双转基因小鼠开始表现增生褶皱的皮肤。皮肤皱纹尤为突出，当动物在第10天的时候，几乎所有的身体部位都连接在一起。此特征在鼻子的周围，眼睑，脚及生殖器部位最严重。整个皮肤异常能在DOX去除后2-3天内逆转。

除了这些皮肤异常，延长产后暴露于DOX的时间会引起极度瘦弱。动物在第2到第3天诱导后停止增重，这样在哺乳期经过4-7天的诱导它们就明显的重量不足（14-16天的小鼠）或断奶后（28天的小鼠）（图2）。这些动物变得非常瘦弱，表现出较少的运动和食物浪费。在DOX控制3-4天这些小鼠也表现出失明的现象。这种失明 部分原因可能是角膜增生（见下文），并且眼睑皮肤的厚度大幅增加（数据未显示，Xie et al.,1998)。动物在经DOX诱导5-7天后死亡而DOX无变化。相反，观察到在受DOX影响下的双转基因小鼠或对照组（单转基因或非转基因小鼠）也没有这些特征（图2）。这些结果与组织学和分子生物学分析，如下暗示ErbB2转基因在有无DOX通过Tet-On转基因系统进行严格控制。

图2 在DOX诱导下双转基因小鼠生长迟缓。对照组（非转基因和 TetRE-ErbB2单转基因）小鼠（空心条），或双转基因（阴影条）小鼠不同时段经DOX诱导后一段时间或者模拟处理进行称重。数据处理后的平均值与标准值有偏差。注意到双转基因小鼠在DOX诱导后逐渐减重，而对照组与双转基因小鼠在没DOX诱导下的重量无差异。

可逆DOX诱导和组织特异性基因表达

转基因的表达通过皮肤RNA Northern杂交确定。探针指向SV40序列下游编码的rtTA和ErbB2定位。在所有 K14-rtTA转基因小鼠中通过检测皮肤rtTA表达的相似水平是否携带这种基因或者TetRE-ErbB2转基因组合。通过单独的DOX处理表达K14-rtTA 的mRNA（图3a，泳道1，3和4）。两条1.4 Kb 与 1.9 Kb的特异性转录rtTA被检测到。 1.9 kb大小的条带与K14 rtTA转基因编码的成熟mRNA相对应。1.4 Kb的条带可能代表的是一种选择性剪接RNA。 rtTA的转录在与rtTA cDNA探针杂交后确定（数据未显示）。与此相反，在TetRE-ErbB2单基因小鼠皮肤（泳道2）与没有DOX诱导的双转基因小鼠（泳道3）中通过皮肤检测没有ErbB2转基因表达。然而在四周大的双基因小鼠（3-8-33）饮水中加DOX（2 mg/ml）持续七天，致使 5.5Kb的TetRE-ErbB2在表皮中高表达（泳道4）。通过相对于内源性ErbB2 mRNA的Northern印迹与ErbB2基因探针杂交确定诱导的转基因表达水平。如图3b所示，5周龄双基因小鼠DOX4天处理后（3-8-110）导致ErbB2 表达量比该基因表达的量高20倍，比内源性表达更高（4.5Kb）（泳道2）。ErbB2基因的诱导表达没有显著改变内源性ErbB2基因的表达（比较泳道1和2），与我们以前的报告(Xie et al.,1998).

ErbB2 的转基因诱导仅限在表皮和其他鳞状上皮（待描述）。在经DOX处理的双基因小鼠肝脏中未检测到ErbB2的转录物，也未在rtTA的肝脏中表达（图3C,泳道6）。DOX能迅速诱导ErbB2表达，并在DOX诱导后4h达到最大（图3C,泳道2），在经DOX诱导后能持续24h的平台期（泳道3-5）。DOX诱导表皮中ErbB2表达是完全可逆的。在DOX停药后2天观察到ErbB2表达显著减少（数据未显示)，到第7天用Northern杂交检测，尽管持续存在rtTA，但没有ErbB2转基因mRNA的表达（泳道7和泳道8）。DOX处理两天的动物在停药7天后再次处理表现出类似的诱导动力学（泳道9），进一步证明相对快速的可逆性和转基因表达的诱导。

图3 Northern杂交分析。10毫克总细胞RNA（a和c）或 从20毫克的从每个皮肤样品的总RNA衍生物的聚（A）RNA（b）进行Northern印迹分析。过滤进行杂交的³²P-标记的SV40 探针（ (a和c)，或或ErbB2的cDNA探针（b）。(a）DOX诱导表皮中ErbB2的表达。在所有K14-rtTA携带动物的皮肤上检出rtTA转录（泳道1和3，4），而该长度为5.5kb的ErbB2转基因的表达，只在处于DOX中的双基因小鼠中观察到（泳道4）。该RNA 在第5道是从由MMTV-ErbB2的转基因小鼠唾液肿瘤衍生，其中的的ErbB2-SV40多聚（A）部转基因与在TetRE-ErbB2的小鼠是相同的 (Xieet al., 1998, 和参考文献)。（b）皮肤活检方法，由 5周龄双小鼠（3-8-110）之前在饮用水加入DOX（泳道1）。在DOX处理后四天进行一次皮肤取样（泳道2）。Northern印迹分析表明，ErbB2的转基因的表达量从检测不到到增加到至少20倍，比内源性的ErbB2表达量更高。ErbB2的基因诱导没有显著改变内源的ErbB2的表达（比较泳道1和2）。（c）时间过程和 双基因小鼠ErbB2的诱导的可逆性。DOX处理之后如图所示。泳道6显示肝脏的RNA。DOX停药7天后诱导能完全逆转，之后2天DOX处理（泳道7和8表示两只小鼠的RNA从两个独立的实验得到），在停药7天后经添加到水中的DOX重新诱导ErbB2表达（泳道9）。

经DOX诱导的双基因小鼠表皮及毛囊的组织学分析

组织学检查发现从成年体双转基因小鼠与未经DOX处理的非转基因动物的皮肤没有区别。表皮呈均匀的厚度，由一个基底细胞层和1〜 2层基底层细胞，并有易于识别的毛囊（图4a）。与此相反，在 经4天DOX处理的5周龄双基因小鼠背部皮肤（3-8- 110）表现出表皮增生并有不均匀的外观 与多达8-10层细胞（图4b）。在各

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