卵黄原蛋白及其受体基因的表达与半社会性昆虫的亲代抚育的相关性研究外文翻译资料

卵黄原蛋白及其受体基因的表达与半社会性昆虫的亲代抚育的相关性研究

原文作者 Eileen M. Roy-Zokan, Christopher B. Cunningham, Lauren E. Hebb, Elizabeth C. McKinney and Allen J. Moore

单位Department of Genetics, University of Georgia, Athens, GA 30602, USA

摘要：膜翅目昆虫中复杂社会行为的发展与生殖途径和基因网络有着密切的关联。在有生殖分工的真社会性的膜翅目昆虫中，卵黄原蛋白影响着职虫的社会行为。我们认为与生殖相耦合的基因可能并不仅仅只存在于真社会性昆虫的演化过程中；例如,可能是社会性演化的早期阶段,比如说亲代抚育的演变（考虑到生殖和亲代抚育鲜有重叠）。因此我们测定了大红斑葬甲的卵黄原蛋白基因的表达与亲代抚育的关联性。我们发现，在亲代抚育较为活跃的期间，大红斑葬甲头部组织中的卵黄原蛋白基因的表达量有明显的下降，同时我们也确认了卵黄原蛋白受体在雌虫和雄虫的大脑中都有表达。我们的研究首次表明卵黄原蛋白的受体基因在非真社会性昆虫的大脑中也有表达。根据两种性别的昆虫的行为和基因表达的联系以及卵黄原蛋白受体在大脑中的存在，我们推测卵黄原蛋白基因对早期的社会演变具有调控作用。本研究使卵黄原蛋白基因和亲代抚育的关系延伸到了半社会性昆虫，不再局限于膜翅目昆虫，并且支持了生殖途径这一假说，同时证明基因表达的异时性在社会分工的演变过程中发挥着重要作用，并先于劳动分工的演变。

关键词：埋葬甲；卵巢假说；亲代抚育；生殖假说；社会性

1. 前言

相比于社会行为进化的原因，我们基本不了解高级的社会行为是如何在基因、生理和发展的基础上演变的。许多研究表明在真社会性昆虫，尤其是蜜蜂中，特定的基因直接调控着社会行为。最典型的就是真社会性昆虫的亲代抚育，后代帮助父母照顾年幼的昆虫的重叠世代和职虫的生殖分工。尽管这些是高度衍生的特性，而且蜜蜂作为一个典型证明了这些特性的演变过程，但是演化简约法认为那些共同的机制和基因基础也会影响有机体的部分或者全部的相关特性。在蜜蜂中卵黄原蛋白与劳动分工和行为分化有着密切的关系，本研究以独立进化的亚社会性甲虫为实验对象来明确卵黄原蛋白的功能，验证卵黄原蛋白基因与非真社会性昆虫的行为改变有关这一推测。我们选择研究亚社会性种群是因为在社会性种群中具有亲代抚育行为，但是没有真社会性昆虫中的阶级分化。亚社会性是被认为真社会性演变的重要前导的行为阶段。

解释真社会性的独特行为特征的机理的假设有卵巢假说，与卵巢生理周期和行为相关联，和生殖假说更具体地指出涉及生殖的基因也调控了职虫等级中的行为区别。生殖假说致力于研究在真社会性昆虫中，当抚育行为转变为觅食时，卵黄原蛋白的水平变化。尽管卵黄原蛋白的主要功能是给正在生长的胚胎提供糖类和脂肪，它也会运输其他的营养物质到卵巢，如金属。卵黄原蛋白可以作为锌离子的运输载体，保护工蜂和蜂王免受氧化胁迫，还有助于延长蜂王的寿命。重要的是，卵黄原蛋白基因的表达影响着多种昆虫的行为。在蜜蜂中，卵黄原蛋白基因的表达与劳动分工有关。该研究表明在工蜂中卵黄原蛋白存在着一种等级特定的表达模式，与觅食者相比，有抚育行为的个体中卵黄原蛋白基因处于更高的表达水平，而且具有更加发育成熟的卵巢。通过RNA干扰使卵黄原蛋白基因沉默，能将抚育的工蜂改变成觅食的工蜂，这一现象表明卵黄原蛋白基因的表达与劳动分工有着直接的练习。在蚂蚁中，卵黄原蛋白也发挥着相似的功能。在最初的真社会性物种——大黄蜂中，卵黄原蛋白基因的表达相较于与生殖状态的关系，更多地关系着社会地位和攻击行为。尽管已经明确这种多功能性的蛋白是真社会性昆虫演变的重要组分，但是这种基因是如何与劳动分工的功能耦合的，以及这种决定行为转化的作用是否是膜翅目独有的，有关这些都尚不明确。卵黄原蛋白基因的作用在社会互作中是否更加普遍？卵黄原蛋白的这种功能又是什么时候就出现的？

在本实验中，我们测试了卵黄原蛋白基因的表达与进化到完全社会性的行为前体——亲代抚育的相关性的特定假设。大红斑埋葬甲是一种亚社会性昆虫，其不存在劳动分工，但有很多亲代抚育行为，例如将消化好的食物反刍给乞求食物的后代。我们以大红斑埋葬甲为实验对象，对卵黄原蛋白在亲代抚育中的作用作了研究。在劳动分工中，亲代抚育是食物采集任务的另一面。亲代抚育是将食物反刍分配给子代或兄弟姐妹而不是收集食物。我们推测卵黄原蛋白与饲养和照料后代的行为表现有关，虽然它可能是有分工的进化过程中再增选，它不是具体到完全社会性的发展。我们对卵黄原蛋白基因的表达假设是基于两个参数。首先，我们认为参与繁殖的基因被增选，是因为父母的照顾和繁殖很少同时出现影响社会的互动，如亲代抚育。因此，从OGPH推断，与生殖相关的增选基因影响父母与子女之间的社会交往是可能的。第二，我们专门针对卵黄原蛋白是因为其在社会性昆虫的作用及其与生殖途径的关系。本研究对埋葬甲的卵黄原蛋白在社会行为中的作用进行了几个独立的测试。另外，虽然很多埋葬甲是双亲的，但大红斑埋葬甲的亲代抚育经常是单亲的（在258组自然状态下的家庭中，有39%是雌性单亲家庭，有5%是雄性单亲家庭；我们实验中的269组家庭中，51%是雌性单亲家庭，3%是雄性单亲家庭；这些数据尚未公布）。这为我们提供了去测定在雌雄个体中基因表达对其行为影响的机会。最后，因为在大红斑埋葬甲中，亲代抚育没有与完全社会性昆虫随着年龄的增长新的种姓的过渡而发生混淆，因此，我们可以检查其表达变化和转变。有研究发现，在孤雌繁殖的蚂蚁中也存在行为分离和永久转变为照顾和繁殖之间的这种蚂蚁周期性工作，但我们研究的优势在于我们同时在雌性和雄性中研究卵黄原蛋白基因的表达和亲代抚育行为。因为雄性个体不产卵，所以在雄性个体中所见的任何差异都是与生殖不相关的。我们的研究中确定了两个大红斑埋葬甲的卵黄原蛋白的基因拷贝。研究显示，在雌性和雄性中，当向亲代抚育行为转变时，卵黄原蛋白及其受体的表达会有所不同。在照料期间表达水平下降，终止照料后，表达水平提高。我们发现卵黄原蛋白受体基因在两性的大脑中都有表达。这些结果都为除了真社会性昆虫以外，卵黄原蛋白基因也会与社会行为耦合。这进一步表明卵巢途径和生殖途径与社会性昆虫的演变以及其更早的形式例如亚社会性行为有着密切的关系。

1. 材料与方法
2. 基因序列测定

我们尚未公布的基因组和转录组数据库中，用tBLASTn对大红斑埋葬甲的vg和vgr基因与核酸库进行比对，比较核算序列的同源性。埋葬甲含有的两条vg基因就是用这一结构域发现的。我们通过输入埋葬甲的两条vg基因（登录号为AAW19633和AY728385）的保守结构域GL/ICG来查找vg基因。GL/ICG是一段接近C末端区域长度约为500bp的保守基元。查找结果回到两个重叠群，这两个重叠群会有限与vg1或vg2的GL/ICG相配对。为这两条基因设计的引物位于序列的3rsquo;和5rsquo;端附近。这两条假定的vg基因序列共有高度同源的序列。设计引物以确保这两条旁系同源物的特异性。引物的序列是可获得的。我们在自己的数据库中用T. castaneum和P. Americana中克隆的序列来查找vgr基因（登录号为XP968903和BAC02725）。查找结果显示了几乎全部的vgr序列。引物的设计以重叠片段中的扩增片段为目标。PCR反应程序如下：94℃预变性5min后进入扩增循环，每个循环94℃变性30s，52℃退火30s，72℃下保持1min，这样循环40次，最后在72℃下保存5min。PCR反应体系采用Termo Scintific。引物序列是可获得的。将PCR产物送至佐治亚大学的研究所进行测序。我们用NCBI中的BLASTp来验证获得的序列与其他昆虫的vg和vgr基因是相似的。

1. 系统发育和进化分析

系统发育分析是在已被验证的大红斑葬甲的预测的vg和vgr基因序列上进行的。直系同源昆虫的vg和vgr蛋白序列从NCBI中用BLASTp获得。用Clustal W的方法在MEGA5.1版中，以BLOSUM的蛋白质重量模型为校准进行序列对齐。我们进行了两个单独的系统发育分析，来检验适合度，分别是最大似然法和贝利叶法。模型测验和贝利叶法一MRBAYES3.2版进行。采用混合模型的方式，我们发现Wag的蛋白质进化模型是最适合三个数据组的数据的。并且在贝利叶法和最大似然法中都用到了该模型。贝利叶法是在5000000代中以500代为采样频率进行的，获得了10000份进化树，在去除25%的进化树后对进化树进行总结。最大似然法是用MEGA5.1，以500为引导参数进行的。

1. 实验设计

实验中用到的大红斑葬甲都保存在饲养埋葬甲的标准条件下。我们用单独的养虫笼将成虫与放养的幼虫分离开。实验中用到的个体都已经在实验室中饲养了3到4个世代（少于1年）。每年我们都会从英国的野外采集一些新的甲虫资源加入到实验室种群中。基因表达分析所用的材料是经历了不同的社会条件的，年龄相仿（羽化后21天）的成年甲虫。成虫的头部样品从五个不同的实验条件的试验组中获取的。这五个条件都代表着生物抚育行为转化的重要事件：空白对照组，配对时没有老鼠尸体的，配对时有老鼠尸体的，照顾幼虫的和照顾后期与幼虫分离的。这五个条件反映了行为和生理上的差异：空白对照组反映了甲虫的基础状态；配对时没老鼠尸体的会有社会性的互动行为但是不会刺激生殖；配对时有老鼠尸体的会有社会性的互动同时也会刺激雌性卵巢的发育和间接的亲代抚育行为（对尸体的保护和防腐）；照顾幼虫的试验组反映了当雌性和雄性不再交配和生殖时，就会和幼虫发生直接的交往行为，成虫会把食物反刍给幼虫，因此有直接和间接的抚育行为；完成抚育后的试验组反映了重新回到交配状态，但是不再生殖抚育后，当在遇到另一个老鼠尸体前就不会有更进一步的社会互作，也不会再生殖。

空白对照组的甲虫有雌虫和雄虫组成，他们在幼虫的时候就已经被分散到独立的容器中。这是没有社交的状态，因为他们在幼虫时就已经雌雄分离。两组有生殖相关的社交行为的试验组，将雄性和雌性在配对箱（17.2times;12.7times;6.4cm）中配对48小时，每个配对箱中，不管有没有老鼠尸体，一半的容积都分别填满尘土。没有老鼠尸体的配对试验组，我们将测定当交配是个体要忍受和相互影响的唯一目的时，他们的一些改变。然后，雌性在没有食物资源的情况下，他们的卵巢不会完全的发育成熟，也不会产卵。当老鼠尸体存在时，我们将检测雌性准备产卵的状态以及雌性和雄性为他们的后代准备食物的状态。另外，还有间接的亲代抚育行为。最后，有抚育行为和抚育完成后的试验组，我们将雌性和雄性放在一个有老鼠尸体的交配箱中，让它们交配48小时。48小时之后，移去一种性别的甲虫从而保证留下来的个体能反映单亲抚育的条件。只有在观察与幼虫的直接交往行为时，雌性和雄性才会被放到一起作为亲代抚育的条件。完成抚育后的甲虫与幼虫分离前的24小时，会从老鼠尸体上移走。它们将被关在一个独立的养虫笼中24小时，以确保它们在死之前已经度过了抚育这一阶段。

收集两种不同的组织类型用于表达分析。整个的头部以及用于验证性分析的完整的大脑组织。将整个头部用液氮进行速冻，在提取RNA之前将其保存在-80℃下。每一个试验组中每个性别分别取10个头部。这种方法的优势在于观察行为状态和保存组织中间基本没有延误。单个的大脑解剖是用ICE-COLD 1times;PBS浸没清洗，并在-20℃下保存于50微升的RNAlater试剂中。解剖在甲虫移出实验条件的5分钟内完成。每个实验条件下每个性别取5个大脑。

1. 实时定量PCR

根据RNA提取试剂盒制造商的说明指导来进行对大红斑葬甲的总RNA的提取。冷冻的头部先用500微升的Qiazol在液氮中初步匀浆。从成虫单独的大脑中提取总RNA用的是Qiagen RNeasy Micro Kit。将大脑样品转移至1.5mL的微型离心管中，加入350微升的Qiazol，用研磨杵研磨成匀浆，再加入350微升的Qiazol，并将样品在室温下静置5min，将140微升的氯仿加入到每个样品中，静置2min，然后将样品在4℃下12000g离心15min。将上清液转移到新的离心管中，将1体积的70%的酒精加入到每个样品中，在转移到离心管中。剩下的步骤按说明指导完成。用Qubit2.0 florometer 将RNA稀释10倍，以RNA为模板，用反转录酶合成第1链cDNA。使用前，将RNA样品保存在-80℃，cDNA保存在-20℃。

Vg和vgr基因的mRNA表达水平的检测采用荧光实时定量PCR的方法。每个实验都是用364孔板跑样。将DNA稀释10倍，取2微升加入10微升的反应体系，反应体系包括5微升的SYBR mix和3微升的正反引物。用软件设计出相应的引物。引物序列如下：Vg1rtSense(5rsquo;-CATTGATGCTGGACGTGTTTCT-3rsquo;）；Vg1rtAnti(5rsquo;-TCAC GTTCGACATAGC

GAGTTT-3rsquo;)；Vg2rtSense(50-CGAATGTTTCTACAAGGATAA-30)；Vg2Anti(5rsquo;-ATCAGA

GTTACGCTGTCCAA-3rsquo;)；VgRrtSense (5rsquo;-AGTGTACGGAGGAAGTCGGG-3rsquo;)；VgRrtAnti (5rsquo;-GGCGTGTCTTCAGAGTGCAA-3rsquo;)。每个样品跑3个技术重复。反应结束后确认扩增曲线。将vg1和vg2的扩增产物进行测序，以确保获得的是目的基因。TATA-binding 蛋白 和alpha-tubulin作为实验的内参基因。引物的效能计算，基因的污染测试和内参基因的选择都参照Cunningham等人的描述

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