二元RNA干扰技术提升大豆异黄酮 生物合成外文翻译资料

二元RNA干扰技术提升大豆异黄酮

生物合成

原文作者 Yina Jiang, Yanlin Hu, Biao Wang and Tianlong Wu

摘要：在这项工作中，一个二元的植物转化RNA干扰（RNAi）载体被用于沉默黄烷酮3-羟化酶（F3H）基因和大豆黄酮合成酶II（GmFNS II）基因。同时，针对上述两个基因分别构建了两个一元的RNA载体。通过农杆菌属ATCC1583介导，上述RNAi显著的调节由大豆子叶诱导而来的毛状根中黄酮和异黄酮的产量。值得注意的是，二元RNAi载体比两个一元RNAi载体对异黄酮产量的调节效果更明显。本研究表明，使用分子的方法可以用来增加大豆异黄酮的产量，并阐明了代谢工程手段改造植物天然产物过程中的的一些挑战。

关键词：二元RNA干扰；黄酮3-羟化酶；黄酮合酶II；异黄酮的生物合成；黄豆

引言

黄酮是次级代谢产物，在植物界中已被发现的黄酮就有超过一万种。所有黄酮合成都遵循两个基本的代谢物丙二酰-CoA和15个碳骨架的对香豆酰-CoA3：1的比例。得到The derived chalcone intermedia得到得到的查尔酮中间体包括2个酚组comprise two phenolic groups that are connected by an open three-carbon bridge.与一个开放相连的三碳桥。这连接的part of an additional heterocyclic six-member ring是一个额外的杂环六元环的一部分，这涉及到邻环中的一个酚组adjacent ring.祖组组。根据他们有最基本的查耳酮骨架结构，各个种类的黄酮都可以被合成，包括黄烷酮类、异黄酮、花青素、黄酮醇、黄烷醇和黄酮。在自然界中，黄酮类化合物参与了许多的biological processes. Plant flavonoids are involved生物过程。植物黄酮参与了在防御中对生物和非生物胁迫的响应。花青素是可见的黄酮类色素，会产生某些红色和蓝色的成熟的水果，这些色素会吸引一些食果动物来帮助分散种子。黄酮在保护抵御紫外线，调节生长素运输和控制花色方面起着重要的作用。异黄酮是大豆中最丰富的黄酮类化合物，在植物与微生物的相互作用中发挥着多种多样的作用。例如，异黄酮的功能是preformed antibiotics, and they act as precursors预制抗生素，他们可以用来作为for the pterocarpan phytoalexins (Eb紫檀碱类植物抗毒素的前体。异黄酮也在微生物基因的感应中起着信号分子的作用，并参与大豆根瘤菌之间的感染和共生。此外，它们对人体的营养和健康有着直接而复杂的影响，它们可以降低胆固醇水平和prevent certain cancers (We预防某些癌症。异黄酮在preventing many hormone-dependent cancers and预防许多激素依赖性癌症方面起着特别重要的作用，同时也these compounds can improve womenrsquo;s health同时也可以改善女性的健康。

代谢工程工具为植物次生代谢产物的调控积累和研究他们在植物防御中的作用提供了新的可能性。基因的过高或过低表达都会控制假定限速步骤的途径，也成功提高了操作基因片编码segments of pathways, ov段路径的生产能力，转录因子的表达则factors that regulate entire metabolic pathways调节了整个代谢途径。大豆中的isoflavones daidzein I, genistein II and glycitein异黄酮大豆苷元I、染料木黄酮II和大豆黄素III都是III are synthesized via the phenylpropanoid通过苯丙素合成pathway and these compounds are stored in the途径来合成的，这些化合物可以和葡萄糖苷和丙二酰葡萄糖苷相结合，并被储存在液泡中。染料木素II，二氢黄酮醇，和芹菜素都是以三种不同分支中的的相同的柚皮素为底物，通过异黄酮合成酶，黄烷酮3 -羟化酶，和黄酮合成酶Ⅱ的催化产生的。重要的是这些酶的基因编码都已被确定的。使用大豆子叶系统的soybean isoflavone synthase genes using the大豆异黄酮合酶基因的RNA干扰（RNAi），将导致植物疫霉属毛根霉菌的易感性增强。因此建议利用RNAi介导抑制异黄酮合成酶途径基因可增加大豆中异黄酮的产量。

在目前的研究中，两个一元RNAi植物转化载体被用于沉默大豆黄酮羟化酶基因（F3H）和黄酮合成酶II基因。此外，二元RNAi载体也被用于以上两种基因。

材料与方法

克隆GmFNSII和F3HF3H的全长cDNA

GmFNSII和F3H的cDNA序列是从SoyBase Gmax的基因组数据库中被确定的。可以从田间栽培的大豆品种“鹤峰织47”幼苗的叶片组织中采用Trizol试剂提取总RNA来获得GmFNSII-2和F3H的全长cDNA。cDNA第一链的拷贝可transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)使用PrimeScripttrade; cDNA第一链Synthesis Kit .合成试剂盒并通过逆转录聚合酶链反应来提取。这些cDNA被用来作为PCR模板，可使用以下引物将全长GmFNSII和F3H的cDNA进行扩增：GmFNSII的GmFNSII-F/R和F3H的F3H-F/R。相应的PCRproducts were cloned into the pMD18-T vector产物将被拷贝到pMD18-T载体中然后进行测序。

二元RNAi载体的构建

一个RNAi载体被用于沉默RGmFNSII转录产物。一个322个碱基编码的区域位于GmFNSIIcDNA的897–1218之间的序列，可以用pMD18–GmFNSII作为模板并通过PCR技术进行筛选和扩增。该正向（5-CTG（ATCGAT/ GGATCCAACTCGGAACCATGTCAAATC-3′)和反向（5-CCGG（TCTAGA/ CTCGAG）GTTTACGCAAACTATTGAACCT-3）引物序列包含两种不同的酶切位点。PCR产物被拷贝到PDK内含子的相反的两侧的PHANNIBAL载体中，并被花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子反向重复驱动。然后，这些GmFNSII RNAi被拷贝到pCAMBIA3300植物表达载体中，包括35S：BAR片段和被消化的SacI/PstI。新的结构被命名为p3300-GmFNSIIi。

一个RNAi载体被用于沉默F3H基因转录产物。一个303个碱基编码的区域位于F3HcDNA 的694-997之间的序列，可以用pMD18-F3H作为模板并通过PCR技术进行筛选和扩增。该正向(5′-CTG(ATCGAT/GGTACC)TGACCTCACTCTTGGCCT-3′) 和反向（5-CCGG（TCTAGA/ CTCGAG）TCTCCTTCTCTTATCTTAGAG-3）引物序列包括两个不同组的限制性位点。PCR产物则被拷贝到pHANNIBAL载体中，然后F3HRNAi被拷贝到如上所述的pCAMBIA3300中并命名为p3300-F3Hi。

一个二元的RNAi载体被用于沉默GmFNSII和F3H的基因转录产物。在pHANNIBAL 和p3300-GmFNSIIi中F3HRNAi的结构可用PstI和PvuI在 限制性位点双倍消化，然后F3HRNAi的结构被拷贝construct was cloned into p3300-GmFNSIIi; th结构被到p3300-GmFNSIIi中；并把它命名为p3300-GmFNSIIi-F3Hi。新构建的p3300-F3Hi, p3300-GmFNSIIi和p3300-GmFNSIIi-F3Hi载体被插入到发根农杆菌ATCC15834中为随后大豆子叶的转化做准备。pCAMBIA3300载体则作为对照。

大豆子叶转化和southern印记杂交

野生型和转化发根农杆菌菌株用酵母抽提物蛋白胨琼脂（YEP培养基）进行持续培养。对于转化菌株，所有培养基中都含有50micro;g mL的卡那霉素。植物接种培养一整夜需要10mlYEP培养基在28℃下培养。cells were pelleted by centrifugation at 5,000 times;g细胞通过在5000g and 4°C for 10 min. Cell pellets were drained4°C下离心分离沉淀10分钟，其中的颗粒被短暂地排干，然后在四分之一强度的MS培养基中渐渐地悬浮。在子叶组织接种之前在600nm处的光学密度是0.5。

子叶的转化也随之进行。大豆品种“鹤峰47”的种子had been stored in a cold room were surface-被储存在一个冰冷的容器里，该容器用sterilized in 70% ethanol for 1 min and then 70%乙醇消毒1分钟，然后用100mL15%次氯酸钠消毒30分钟，偶尔agitation.搅拌。之后，十个种子被放置到每个都each Petri dish that contained germination medium含种子萌发所需营养物的培养基的培养皿中。种子发芽at 26°C under a 16-h photoperiod. Then,在26°C的16 h光照下需5-7d。然后，用表面无缺陷的cotyledons showing no surface blemishes were子叶在距sampled at 0.3 cm away from the petiole end by在距离离叶柄0.3厘米处进行采样making small, circular (0.4 cm diameter) incisions.制作小的圆形（直径0.4厘米）切口。六个子叶的切割面被放置在有在to 9-cm sterile filter paper in each plate, and this有9厘米大小的无菌滤纸的各个盘子中，这使浸没were exposed to 20 micro;L of A.进门，浸没浸没浸没于20micro;L发根农杆菌悬浮液中的子叶有湿润的表面。Plates were wrapped in Parafilm and用封口膜包裹放置于珀西瓦尔孵化器中，温度为22℃光照12小时。

在转化三周之后，毛根的基因组DNA(30-60micro;g)中含有野生型和转化的载体可以用Pst I切割和消化DNA，然后用1%琼脂糖凝胶分离，变形，再转移到带正电荷的尼龙膜上，这是southern印记杂交法制造商的说明。这个DNA探针（大约是600个碱基），包含了pCAMBIA3300载体的编码区域，可以通过引物BAR-F 和BAR-S来进行检测，并用碱性磷酸酯酶和胶片CDPStar化学发光检测试剂来标记。并在55℃进行严格洗涤。

对GmFNSII和F3H进行定量PCR分析

从每个转基因的野生型和转化载体的15个毛状根中分离出总RNA。毛状根样品用Trizol试剂进行处理，然后用DNase I去除所有污染的基因组DNA。再用PrimeScripttrade;cDNA第一链合成试剂盒通过RT-PCR将其拷贝 。实时荧光定量PCR和一个7300的实时PCR系统（应用生物系统），对初始转录浓度的计算是根据比较阀值法来确定的。在每个RNA的制备中，大豆肌动蛋白基因的转录丰度都被作为其内部标准。PCR引物可在肌动蛋白中的肌动蛋白-F和肌动蛋白-R间进行使用，而实时荧光定量PCR_FNS-F 和 实时荧光定量PCR_FNS-R可用于GmFNSII的制备，实时荧光定量PCR_F3H-F 和实时荧光定量PCR _F3H-R 则可用于F3H的制备。

高效液相色谱法对黄酮类化合物的分析

为了评估黄酮类化合物的成分，可将100毫克转基因的毛状根放在液氮中，然后用4mL80%甲醇提取2小时，并使用超声波处理（100瓦）。采用高效液相色谱法，使用安捷伦1100系列高效液相色谱系统和Venusil MP-C18 column (2.1times;150 mm, 5 micro;m,2.1times;Venusil mp-c18柱，将各提取物的等分试样在260 nm下进行分析。样品采用15%-85%的线性梯度进行分离，高效液相色谱中的甲醇流动30分钟，且流速为每分钟1ml。保留时间和紫外线spectra were compared with authentic standards光谱与可用的真实标准进行比较，每个化合物的数量通可过真实的标准曲线被计算出来。大量的大豆异黄酮苷元葡萄糖结合物conjugates (daidzin, genistin and glycitin) and（大豆苷元、染料木素和黄豆黄素）和丙二酰葡萄糖结合物malonyl-glucose conjugates were determined for丙和每个单独的异黄酮大豆苷元、染料木素II和glycitein III.黄豆黄素III总量都可被测定。

结果

二元RNAi载体的构建

为了确定GmFNSII和F3H在黄酮类化合物特别是大豆异黄酮中的作用，两个一元的RNAi载体和一个二元的RNAi载体被用于大豆中

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