斯氏按蚊脂肪体中增加的胰岛素信号调节代谢并增强宿主对细菌攻击和恶性疟原虫感染的反应外文翻译资料

斯氏按蚊脂肪体中增加的胰岛素信号调节代谢并增强宿主对细菌攻击和恶性疟原虫感染的反应

原文作者 Lewis V. Hun^{a , b} , Kong Wai Cheung ^c , Elizabeth Brooks^b , Rissa Zudekoff ^b , Shirley Luckhart ^d ,Michael A. Riehle^{b , *}

单位

^a Department of Entomology, University of California Riverside, Riverside, CA, USA

^b Department of Entomology, University of Arizona, Tucson, AZ, USA

^c Department of Medical Microbiology and Immunology, University of California Davis, Davis, CA, USA

^d Departrment of Entomology, Plant Pathology and Nematology and Department of Biological Sciences, University of Idaho, Moscow, ID, US

摘要：在脊椎动物和无脊椎动物中，胰岛素/胰岛素样生长因子1 (IGF1)信号(IIS)级联是高度保守的，并在许多不同的生理过程中起着至关重要的作用。在蚊子对IIS做出反应的许多组织中，脂肪体在新陈代谢、寿命、生殖和先天免疫中起着核心作用。我们之前证明了在斯氏按蚊和埃及伊蚊中脂肪体特异性表达活性Akt，一种关键的IIS信号分子，激活IIS级联反应并延长寿命。此外，我们发现转基因雌性蚊子比非转基因蚊子产生更多的卵黄蛋白原(Vg)蛋白，尽管这并没有转化为繁殖力的增加。这些结果促使我们进一步研究IIS如何影响这些转基因蚊子的免疫、代谢、生长和发育。我们观察到，与非转基因同胞对照相比，年轻(3-5天)转基因蚊子的糖原、海藻糖、甘油三酯、葡萄糖和蛋白质发生了显著变化，而年长(18天)转基因蚊子只有甘油三酯发生了显著变化。更重要的是，我们证明了增强的脂肪体降低了转基因斯氏按蚊中恶性疟原虫感染的发病率和强度。此外，与非转基因对照相比，用革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌攻击转基因斯氏按蚊改变了几种抗微生物肽(AMPs)和两种抗疟原虫基因，一氧化氮合酶(NOS)和硫酯补体样蛋白(TEP1)的表达。与非转基因对照相比，成年雌性斯氏按蚊脂肪体中IIS的增加对转基因蚊子后代的身体大小、生长或发育几乎没有影响。这项研究证实并扩展了我们对胰岛素信号在调节蚊子脂肪体多种功能中的关键作用的理解。

关键词：胰岛素信号； 斯氏按蚊； 蚊子；新陈代谢；先天免疫

1. 介绍

疟疾仍然是世界范围内的一个主要问题，每年估计有2 . 29亿个病例，超过400，000人死亡(世界卫生组织，2020)。虽然长效驱虫蚊帐的广泛分发改善了这一状况，但除非能够找到新的控制战略，否则药物和杀虫剂耐药性的增加很可能会限制这些成果。胰岛素/胰岛素生长因子1信号传导(IIS)级联作为对载体能力至关重要的多种生理学的中央调节器，包括先天免疫、生殖、生长、代谢和寿命(Ahlers等人，2019；安东诺娃等人，2012年；Hun等，2019；凌等，2017；凌和赖克赫尔，2021；Sharma等人，2019)。因此，IIS是减少蚊虫媒介中寄生虫感染和限制寄生虫传播的有吸引力的目标。IIS以组织特异性的方式发挥作用，根据每个组织的要求控制细胞代谢(安东诺娃等人，2012；李等，2020；Nandi等人，2004年；萨尔蒂尔和卡恩，2001年)。在昆虫中，胰岛素样肽(ILPs)主要表达在位于头部大脑中间部的中间神经分泌细胞(MNCs)中。然而，ILPs的表达也在多种其他昆虫组织中得到表征，包括中肠、卵巢、神经胶质细胞、脂肪体和成虫盘(Das和Arur，2017；林和斯马格，2019；马尔克斯等人，2011；Nauml; ssel等人，2013年；Riehle等人，2006年)。当分泌时，ILPs激活一系列组织中的IIS级联，包括中肠、卵巢和脂肪体，以引发特定的生理效应。昆虫脂肪体特别有趣，因为该组织中的IIS已被证明在能量代谢、繁殖和寿命中起着重要作用(Arrese和Soulages，2010；白等，2012；李等，2019)。昆虫脂肪体也是针对多种病原体的转录诱导的体液免疫反应的主要位点(Ali Mohammadie Kojour等人，2020；勒迈特和霍夫曼，2007年；王等，2018)，虽然IIS对脂肪体免疫的作用尚不明确。

先前对果蝇的研究揭示了免疫途径的IIS调节(DiAngelo等人，2009；Dionne，2014；Dionne等人，2006年；Hotamisligil，2017；Rynes等人，2012年)。例如，以非组织特异性方式激活FOXO导致在幼虫和成虫中强烈诱导抗微生物肽(Becker等人，2010；郭等，2014)。果蝇胰岛素受体底物直系同源物chico中的突变与果蝇受到攻击时感染抗性增加和细菌载量减少相关(Libert等人，2008；麦科马克等人，2016)。果蝇FOXO调节雷帕霉素靶(TOR)下游的抗微生物肽(AMP)表达，并且对于饥饿期间控制AMP基因表达是必需的(Becker等人，2010；Varma等人，2014年)。果蝇幼虫脂肪体中Toll信号通路的激活已被证明通过阻止Akt的磷酸化和限制dilp6的脂肪体表达来破坏IIS(Roth等人，2018；Suzawa等人，2019)。在蚊子中，IIS级联同样有助于对病原体的先天防御。Pakpour等人(2012年)和Surachetpong等人(2011年)确定，包括转化生长因子-beta;1和胰岛素在内的血粉成分激活了斯氏按蚊的IIS和MAPK信号通路，斯氏按蚊是疟原虫的一个关键载体，已成为非洲的一个新威胁(Sinka等人，2020年)。这导致蚊子更容易感染人类疟原虫恶性疟原虫。相反，在血粉中提供人胰岛素样生长因子(IGF)-1的蚊子表现出对恶性疟原虫的易感性降低(Drexler等人，2013年)。此外，Akt的活性形式(IIS途径的关键激活剂)在斯氏按蚊中肠的过度表达完全阻断了恶性疟原虫的发育(Corby-Harris等人，2010)。进一步的研究表明，这种寄生虫阻断表型源于线粒体衍生的活性氧和氮物种的合成增加，以及不利于寄生虫发育的环境(Luckhart等人，2013年)。令人惊讶的是，抑制因子的中肠表达也与斯氏按蚊对恶性疟原虫的易感性降低有关，尽管在这种情况下改善了中肠上皮的完整性，并且可能耗尽了泛酸，泛酸是寄生虫所需的辅酶a的前体，导致寄生虫死亡(Hauck等人, 2013；Souvannaseng 等人, 2018).除了IIS操作对寄生虫感染的影响之外，操纵ILP水平改变了斯氏按蚊对恶性疟原虫感染的易感性。具体来说，就是敲除斯氏按蚊ilp3或ilp4降低了恶性疟原虫感染的患病率和强度，并增加了抗寄生虫基因的表达(Pietri 等人, 2015)。当向斯氏按蚊提供ILP4时，寄生虫的患病率和感染强度显著增加，而ILP3的供应显著降低了感染患病率(Pietri et al., 2016).

除了在昆虫宿主防御中的作用，IIS还是一个重要的脂肪体内营养代谢的调节剂，是昆虫能量调节和营养储存的主要场所。ILPs和IIS诱导脂肪体细胞将葡萄糖转化为糖原，并从分解代谢转变为合成代谢脂质和蛋白质代谢。在黑腹果蝇中，敲除DILPs，单独或联合，表明DILPs 2、3、5、6和7共同调节碳水化合物和脂质代谢(Gronke et al., 2010；Semaniuk et al., 2018；Zhang et al.,2018)。Slaidina等人(2009)表明在幼体饥饿条件下，dilps 2、3和5的表达受到抑制，而脂肪体特异性dilp6被诱导。在成年果蝇中，脂肪体中胰岛素受体活性的增加导致三甘油酯水平和脂肪细胞数量显著增加，而dFOXO活性的增加导致脂肪细胞数量减少(DiAngelo et al., 2009)。在吻虫罗地牛中，Rhopr-ILP的敲除导致循环脂质和碳水化合物增加，但脂肪体碳水化合物减少(Defferrari et al., 2016)。在埃及伊蚊中，断头后注射ILP3与糖原和脂质储存显著增加和循环海藻糖水平降低有关(Brown et al., 2008).通过CRISPR/Cas9破坏埃及血吸虫中的ILP7导致甘油三酯水平升高和糖原水平降低，而破坏ILP8具有相反的效果(Ling et al.,2017)。这些表型的复杂性突出了一个事实，即需要对蚊子IIS调节营养代谢的作用进行额外的研究。

在我们之前的研究中，我们在脂肪体和血粉特异性卵黄蛋白原(Vg)启动子的调控下，将一种活性形式的IIS激酶Akt基因工程改造到斯氏按蚊和埃及伊蚊蚊子体内(Arik et al., 2015)。我们发现，这些TG蚊子比NTG同胞对照组存活时间明显更长，这可能是由于ilp2在大脑中的表达减少和推定的胰岛素结合蛋白imp-l2的表达增加。我们还发现TG蚊子比NTG对照组产生明显更多的Vg转录物和蛋白质，尽管我们令人惊讶地没有观察到雌性繁殖力的任何变化(Arik et al., 2015；Hun et al., 2019)。虽然产卵量没有增加，但雌蚊可能为其后代提供了额外的储备，从而在胚胎发生期间为它们提供了更多的资源，或者它们可能只是将这些多余的蛋白质重新分配给其他用途。在这项研究中，我们试图利用Vg-Akt转基因斯氏按蚊解决脂肪体IIS对先天免疫、代谢和后代适合度的作用。

1. 方法
   1. 蚊子培养

斯氏按蚊(印度株)蚊子如前所述饲养(Corby-Harris et al., 2010).在相同条件下，半合子转基因(TG)蚊子品系每一代都与野生型群体蚊子异交，以增强遗传多样性，产生半合子TG和非转基因(NTG)同胞蚊子50:50的混合物。使用奥林巴斯SZX10荧光体视显微镜(日本东京奥林巴斯)和用于检测增强型绿色荧光蛋白的适当过滤器(EGFP)，在蛹阶段分离TG和NTG蚊子。为了线路维护和实验，向雌蚊提供了人血(美国红十字会；IBC协议2010–014)。

• 1. 代谢分析

为了确定TG和NTG蚊子的营养储备，收集幼蚊(3-5d)和老蚊(18 d)并让它们交配48 h。然后通过人工膜喂食器为蚊子提供45分钟的血粉。在血粉(PBM)后的不同时间点(非血液喂养或NBF，24、36、48和72小时)收集两种血液喂养的雌性TG和NTG斯氏按蚊蚊子的全身并和磷酸盐缓冲盐水混合(PBS50 mM氯化钠，50 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2)。对于18天的蚊子代谢试验，所有雌性蚊子每2天吃一次血餐，直到羽化后18天。然后按照对年轻蚊子的描述收集样本。

按照改进的微分离方案从两只蚊子中提取葡萄糖、糖原、海藻糖、甘油三酯和蛋白质(Telang and Wells, 2004；Zhou 等人, 2004).一旦分馏，葡萄糖、糖原、海藻糖、甘油三酯和蛋白质提取物在80℃下冷冻，直到营养物如下所述定量。使用独特的蚊子群对每个实验进行了三次生物重复。为了对甘油三酯进行定量，使用了香草醛试剂(Van Handel, 1985a, 1985b)分析并进行一下修正。三油酸甘油酯的储备溶液(1.0毫克/毫升，密苏里州圣路易斯适马-奥尔德里奇)用于生成0至200微克的标准曲线通过在65℃除去氯仿来干燥冷冻的脂质部分。接下来，向干燥的样品中加入100mu;l 95%硫酸，再悬浮的样品涡旋并在100℃加热10分钟。样品在室温下冷却10分钟，加入2 ml香草醛试剂，样品涡旋振荡。样品在黑暗中显影15分钟，将100 mu;l样品加入96孔板中，一式三份。使用分光光度计(马萨诸塞州沃尔瑟姆热科学公司的Multiskan Go)对照空白试剂对照记录525 nm处的吸光度。

使用改进的基于蒽酮的测定法来定量糖原(Van Handel, 1985a,1985b).稀释1.0毫克/毫升糖原储备(Thermo Scientific，Waltham，MA)，生成0–200微克标准曲线。在微分离的最后一步，糖原样品沉淀形成沉淀并干燥。糖原颗粒用200mu;l 25%乙醇溶解并涡旋震荡。随后，加入蒽酮试剂2 ml，样品再次涡旋震荡，然后在黑暗中于90℃孵育20分钟，以保护反应免受光照。样品在4℃下

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