免疫缺陷途径调节果蝇的代谢稳态外文翻译资料

免疫缺陷途径调节果蝇的代谢稳态

作者：Saeideh Davoodi,* Anthony Galenza,* Andrew Panteluk,* Rujuta Deshpande,dagger;,Dagger; Meghan Ferguson,* Savraj Grewal,dagger;,Dagger; and Edan Foley*

摘要：

免疫和代谢途径共同影响宿主对微生物入侵者的反应，一种途径中的突变经常会破坏另一种途径中的活性。我们使用果 蝇模型来表征具有改良免疫缺陷 (IMD)途径活性的果蝇的代谢稳态。IMD 途径与哺乳动物 TNF-a 途径非常相似，后者是脊椎动物免疫和代谢的关键调节因子。我们发现，IMD的持续激活导致高血糖症 、脂肪储备减少和发育延迟，提示 IMD参与代谢调节。与这一假设一致，我们发现 imd 突变体体重更重，属于高脂血症，并且葡萄糖耐量受损。为了测试代谢调 节对宿主对细菌感染的反应的重要性，我们用致死剂量的几种果蝇病原体对胰岛素途径突变体进行了挑战。我们发现，胰岛素途径中的功能丧失突变会影响宿主对感染的反应，其方式取决于感染途径和传染性微生物的身份。综上所述，我们的结果支持免疫和代谢途径的协调调节在宿主遏制微生物入侵者中的作用。《免疫学杂志》， 2019， 202:2747-2759。

1引言

胃肠道是以防止微生物渗透宿主内部并允许必需营养物有序流动的方式处理摄取的物质的器官。一旦进入宿主体内，营养素就启动控制生长和发育的信号转导途径。在动物进化过程中，杰出的代谢调节因子很早就出现了——就胰岛素肽而言，估计是在10亿年前 (1)——并且在整个动物界执行保守的功能。例如，在蠕虫、苍蝇和啮齿动物等多种动物中，胰岛素肽控制营养物质的摄取和储存，激活细胞生长，并影响存活率(2-4) 。

感染后，代谢发生根本性转变(5)。此时，种系编码的模式识别受体检测外来微生物的分子特征，并启动旨在中和入侵者和优化宿主存活的生理反应。我们倾向于将重点放在免疫 上，即生成能够消灭入侵者和感染细胞的分子。然而，微生物检测会引发一系列复杂的反应， 其中可能包括各种各样的因素，如体温升高、嗜睡、食欲不振、社会隔离和耐受机制，这些因素可中和病原体而不影响其数量(6)。代谢适应是宿主对感染的反应中的一个共同主题(7)。在这种情况下，宿主会平衡传统代谢需求与微生物带来的直接威胁，并相应地改变代谢途径活性。

免疫和代谢途径的整合在果蝇等昆虫中尤为明显，其中脂肪体同时调节能量储存和体液免疫。在最佳条件下，幼虫脂肪体检测血淋巴中的循环糖和氨基酸，以控制果蝇胰岛素样肽 (dILPs) 从脑中的释放(8)。dILPs进入循环，协调肌肉和脂肪等代谢器官的活动。同时，模式识别受体会检查血淋巴中是否存在指示感染的微生物相关分子模式。几种类型的微生物相关分子模式激活脂肪体中Toll 介导的反应(9)，而免疫缺陷(IMD)途径(TNF途径的进化亲戚) (10)对含有肽聚糖的细菌二氨基庚二酸产生反应(11)。宿主整合来自免疫和代谢途径的信号，以确定脂肪体的净输出。例如，在高养分利用 率和微生物检测有限的时期，果蝇 MEF2 转录因子被磷酸化并促进脂肪生成和糖原生成，这是支持动物生长的分子途径 (12)。然而，细菌感染会导致 MEF2 磷酸化丧失，这是一种将脂肪体的活性从能量储存的积累转移到抗菌肽释放的事件。这种代谢变化在果蝇对感染的反应中很常见并且经常包括雷帕霉素(TOR)途径元件的胰岛素/靶的活性的改变(13,14) 。

免疫和代谢途径之间的分子联系在巨大的进化距离上是保守的，异常的免疫-代谢信号与几种病理状态有关。例如，炎症与慢性代谢性疾病的发生有关，如胰岛素抵抗和2型糖尿 病(15，16)。在肥胖的实验模型中，脂肪组织常驻巨噬细胞产生TNF (17，18)，并且TNF有助于肥胖诱导的胰岛素抵抗的发展(19-21)。事实上，抗炎水杨酸盐治疗可改善肥胖诱导 的胰岛素抵抗和2型糖尿病(22，23)。然而，尽管炎性线索对代谢稳态有影响，但我们并不完全了解各通路是如何沟通的。

我们使用果蝇模型来表征IMD对免疫-代谢稳态的贡献。我们发现，脂肪体内的 IMD 活化具有宿主代谢改变的分子、遗传和表型特征。从转录角度上看，IMD 激活导致基因表达信 号与胰岛素/TOR 活性降低一致。生理上，IMD 激活导致脂质储备耗竭、高血糖、发育延迟和成人体型缩小。在后续研究中，我们发现功能丧失型 imd 突变体体重更重，且胰岛素信号传导失调、高脂血症和葡萄糖耐量异常。 IMD与代谢之间 的明显联系促使我们推测，关键代谢调节因子(如胰岛素途径成分)的丢失将对果蝇在微生物感染后存活的能力产生可测量 的影响。为了检验这一假设，我们确定了常见蝇类病原体对 野生型或胰岛素途径突变蝇类存活的影响。我们发现胰岛素途径的突变显著影响宿主存活和细菌载量，其方式取决于 感染途径和传染性微生物的身份。我们的结果支持了一个模型，即整合的免疫-代谢活性对于宿主对微生物感染的反应至关重要。

2材料与方法

2.1果蝇方法

在标准玉米粉培养基(Nutri-FlyBloomington配方https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html; Genesse Scientific)。所有的成年实验都是使用处女雄蝇和雌蝇进行的。对于使用保持整体观饮食的果蝇进行的实验，整体观培养基是根据已公布的方案和处方，使用100 mM生物可利用氮的原始氨基酸溶液 (Oaa)制备的 (24)。糖/酵母 (SY)饮食由 0.15M 蔗糖、100 g/l (w/v)酵母提取物和1% (w/v)琼脂组成。蔗糖水平升高的高 SY 版本(SYS)饮食由1 M 蔗糖、100 g/l (w/v)酵母抽提物和1% (w/v)琼脂组成。本研究中使用的蝇类如下 :w¹¹¹⁸、R4-GAL4、UAS- ImdCA、impl2def2、ilp2，3，5、 Ilp2HF 和 imd ^EY08573(null)突变体。本研究中使用的 imd 突变体在使用前与 w¹¹¹⁸ 果蝇回交 8 代。为了测量发育率, 在 25℃培养了25只年龄匹配的取食三龄幼虫，并监测游走三龄幼虫、蛹和羽化成虫的形成。对于蛹期，在25℃培养 25 只年龄匹配的三龄幼虫，并监测发育至 P13蛹期所需的时间长度。发育和蛹变异分析一式四份。为测量总甘油三酯 (TG)，称取10只3龄幼虫或5只成年苍蝇，在TE缓冲液中用0.1% Triton X-100匀浆。使用血清TG 测定试剂盒(TR0100 适马)根据制造商的说明。通过在TE 缓冲液中均质化10 只3龄幼虫或5只成蝇，并使用GAGO葡萄糖测定 试剂盒(GAGO20 适马)根据制造商的说明。对于海藻糖血淋巴测量，将15组3龄幼虫浸入卤代烃中油 700(适马)，表皮被刺穿开始血淋巴出血。使用玻璃移液管抽吸油 滴上积聚的血淋巴，并立即在干冰上冷冻。将1微升he- molymph 与99 ml海藻糖酶缓冲液(5 mM Tris pH 6.6，137 mM NaCl，2.7 mM KCl)混合，并在70℃下加热 5 min，使内源性海藻糖酶失活。使用或不使用猪肾海藻糖酶处理样本(t 8778-1 un; 适马)。并在 37℃孵育16小时，然后通过添加葡萄糖测定试剂(GAGO20 适马)，在 37℃孵育 30 分钟，然后加入12 N 硫酸终止。在540 nm处测量吸光度。为了计算海藻糖水平，我们从用海藻糖酶处理的样本的葡萄糖水平中减去未处理样本的葡萄糖水平。如前所述进行毛细管加样器(caf)分析 (25)。我们通过将琼脂留在毛细血管中的方式提供了前面提到的整体液体食物。每个小瓶含有三个毛细管，内含10只成年苍蝇。每24 h 计算一次总消耗量，连续 5 d。尼罗红染色:取10只3龄幼虫解剖于 PBS 中， 4%甲醛固定30 min。 用13ml PBS 洗两次后，用1:1000 的 尼罗红贮备液(0.5 mg/ml 丙酮)和 1:500 的 Hoechst 33258 对脂肪组织染色 30 min。将染色组织固定在载玻片上，并使用旋转圆盘共聚焦显微镜 (Quorum WaveFX)进行观察。脂质面积用 Columbus 软件 (PerkinElmer)定量。 如前所述计算瞳孔体积(26)。简而言之，产卵后 24 小时，收集幼虫并以 50 只幼虫为一组放入食物小瓶中。使用画笔，从瓶的侧面拾取 1-d 龄的蛹。使用蔡司立体发现 V8 显微镜(放大 314 倍)对蛹进行成像。使用 AxioVision 软件测量每只蛹的长度和宽度。 假设蛹为圆柱形，使用公式(4/3p) 3(长度/2) 3(直径/2)2 计算蛹体积。

2.2高通量果蝇定量喂养系统

我们从P.M. Itskov 博士(27岁)处获得了FlyPAD（高通量果蝇定量喂养系统）仪器。我们饲养了雄性 w¹¹¹⁸ 和 imd 果蝇，进行了20 d 的整体观饮食。对于 FlyPAD 实验，我们使用了琼脂糖代替琼脂的整体观培养基。将准备好的食物在 95°C下融化，然后在 60°C 下保持不变，以利于倾倒。对于每种基因型，在n = 32 时，使用口腔抽吸器将单只苍蝇放入每个蝇笼，记录进食行为1 h。

2.3口服葡萄糖耐量试验

将w¹¹¹⁸ 和 imd雄性在 1%琼脂上饥饿过夜16 小时，切换到含有 10% 葡萄糖和 1%琼脂的小瓶中 2 小时，然后在 1%琼脂的小瓶中重新服务。在初始饥饿后、在 10%葡萄糖条件下 2 小时后，以及在再观察后 2 小时和 4 小时采集 5 只苍蝇的样本。称取五只苍蝇的样本，然后在125 ml TE 缓冲液 (10 mM Tris，1 mM EDTA，0.1% Triton X- 100，pH 7.4)中捣碎。使用葡萄糖氧化酶(GO)检测试剂盒(GAGO20适马)。

2.4酶联免疫吸附测定

为了测量循环和总ILP2 水平，我们使用了从 Kim 博士处获得的 ilp21 gd2HF飞行储备和方案(28)。为了制备样本，我们将腹部的黑色后端切开，并将10具切开的雄性尸体转移至60ml PBS 中，然后以最大速度涡旋 10min。我们以 1000plusmn;3g 离心这些试管 1 min， 并将 50 ml 上清液转移至 PCR 试管中，作为我们的循环 ILP2HF 样本。我们将 500 ml 含 1% Triton X-100 的 PBS 加入含有剩余苍蝇的试管中，并使用杵和无绳电机(VWR 47747-370)捣碎样本，然后以最大速度涡旋 min。我 们将这些试管以最大速度离心 5 min， 然后将 50 ml 上清液转移到 PCR 试管中，作为我们的总ILP2HF 样本。对于标准品，我们使用FLAG(GS)HA 肽标准品(DYKDDDDKGGGGSYPYDVPDY酰胺，2412d； LifeTein)。我们将 1 ml 储备肽标准溶液(0-10 ng/ml)加入 50ml PBS 或加入 1% Triton X-100 的 PBS 中。我们在 Nunc MaxiSorp 平板(44- 2404-21；Thermo Fisher Scientific)，加入 100 ml 的 anti-FLAGAb，在 0.2 M 碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH 9.4)中稀释至 2.5 mg/ml，然后在 4℃下孵育平板过夜。用含0.2% Tween 20 的 PBS 洗涤平板两次， 然后用 350 ml 含2% BSA 的 PBS 在 4℃下封闭过夜。我们以高亲和力稀释了抗 HA-过氧化物酶(克隆3F10，25 mg/ml，编号12013819001；罗氏)，在 PBS 中，加入2% Tween， 稀释度为 1:500。 然后，我们向含有 50 ml 样本或标准品的 PCR 试管中加入 5 ml 稀释的 抗 HA-过氧化物酶， 涡旋，并短暂离心。阻断后，我们用含0.2% Tween 20 的 PBS 洗涤平板三次。将样本和标准品转移至板的孔中，并用粘性密封剂(MSB-1001； Bio-Rad)，然后置于 4℃的潮湿室内过夜。用抽吸器取出样本，并用含0.2% Tween 20 的 PBS 洗涤平板 6 次。加入 100ml 1-Step 超 TMB-ELISA 底 物 ( 编号 34028； Thermo Fisher Scientific)加入到每个孔中，并在室温下培养30 min。加入100ml 2m 硫酸终止反应，在 450 nm下用SpectraMax M5(分子器件)测定吸光度。

2.5生物信息学

对于微阵列研究，我们使用基因芯片果蝇基因组2.0 阵列 (Affymetrix)在三次测定中测量基因表达。使用 TRIzol 提取 3 龄幼虫的总RNA。我们使用 100 ng 纯化 RNA，使用 genes chip 39 IVT Plus 试剂盒(Affymetrix)制备标记的cRNA。我们使用转录组分析控 制台软件(Affymetrix)对基因表达数据进行初步分析。阵列数据已提交给国家生物技术信 息中心基因表达综合数据库(注册号GSE109470，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi? acc=GSE109470)。使用基因集富集分析 (2

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