一、课题背景
DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶（DNMTS）将甲基从S-腺苷蛋氨酸转移到胞嘧啶的5位来完成的，参与调控基因的表达和细胞分化的过程，在哺乳动物的发育中有重要的作用。其特点：DNA甲基化是重要的表观遗传修饰，主要发生在DNA的CpG上，通过DNA甲基化转移酶（DNMTs）来完成，可分为高甲基化和低甲基化。而高甲基化意味着基因的沉默，低甲基化意味着基因的激活。
对于不同肿瘤细胞的DNA分析表明，癌变细胞中出现基因突变的概率要远远低于预期，而在转录组范围范围内检测结肠直肠癌中由启动子高甲基化引起的基因表达抑制，发现高达5%的已知基因在肿瘤细胞中发生了异常的启动子高甲基化，由此可以推测，与基因突变相比，DNA甲基化改变在细胞恶变过程中可能发挥了更大的作用。
在哺乳动物基因组中，DNA甲基化是一种表观遗传机制，包括将甲基转移到胞嘧啶的C5位形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通过招募参与基因抑制的蛋白质或抑制转录因子与DNA的结合来调节基因的表达。在发育过程中，基因组中DNA甲基化模式的改变是包括从头DNA甲基化和去甲基化的动态过程的结果。结果，分化的细胞发展出稳定和独特的DNA甲基化模式，调节组织特异性基因转录。在本章中，我们将回顾神经系统中DNA甲基化和去甲基化的过程。我们将描述DNA(去)甲基化机制及其与其他表观遗传机制的关系，如组蛋白修饰和非编码RNA。有趣的是，有丝分裂后神经元仍然表达DNA甲基转移酶和参与DNA去甲基化的成分。此外，神经元的活动可以调节它们的DNA甲基化模式，以响应生理和环境刺激。DNA甲基化的精确调控对于正常的认知功能至关重要。事实上，当DNA甲基化由于发育突变或环境风险因素(如药物暴露和神经损伤)而改变时，精神损伤是一种常见的副作用。对DNA甲基化的研究继续显示出关于中枢神经系统表观遗传基因调控的丰富而复杂的图景，并为神经精神疾病的治疗提供了可能的治疗靶点。【4】
同时，DNA的甲基化改变也为癌症的诊断和治疗提供了一条新的途径。通过检测DNA甲基化可以提前发现癌变；通过纠正DNA甲基化异常则可能逆转细胞的恶变。进一步阐明肿瘤细胞特异DNA甲基化改变的机制及与肿瘤发生发展的关系，将为最终攻克肿瘤治疗难题提供新的思路。
甲基化CpG结合蛋白是一类与甲基化CpG岛特异性结合的转录调控因子，其能在启动子的甲基化CpG岛区募集DNA甲基转移酶、组蛋白甲基化酶和组蛋白去乙酰化酶，介导基因表达沉默，在抑癌基因沉默。X染色体失活及印记基因沉默中发挥关键作用。Mecps 含有保守的甲基 CpG 结合域， 是其与甲基化 DNA 结合的关键区域。由于 MBD 具有特异结合甲基化 DNA 的特点， 已被用于制备 MBD 亲和柱和甲基化芯片。【3】
由合成分子和蛋白质组成的杂交探针是检测活细胞中生物分子和信号的有力工具。到目前为止，大多数杂交探针的目标都被限制在pH值和小分析物上。尽管生物大分子对细胞的生理功能是必不可少的，但基于杂交探针的方法还很少用于活细胞检测生物大分子。在这里，我们准备开发一种带有化学开关的混合探针，用于甲基化DNA的活细胞成像，甲基化DNA是抑制基因表达的重要大分子。利用蛋白质标记技术，我们准备创建一个包含DNA结合荧光素和甲基化DNA结合结构域的杂交探针。该杂交探针在与甲基化DNA结合时增强了荧光强度，并在有丝分裂过程中成功地监测了甲基化DNA。该杂交探针具有基于小分子或荧光蛋白的探针所不具备的显著优点，可用于活细胞分析与DNA甲基化相关的表观遗传现象和疾病。【1】
- 要解决的问题
构建甲基化胞嘧啶识别域重组蛋白。选择带有不同连接基团的核酸探针（氨基、羧基等）与重组蛋白进行连接。针对不同的连接方式，优化连接反应条件，实现蛋白与核酸探针的高效率连接，同时保持蛋白的DNA甲基化识别功能。
- 可行性分析
设计基本原理如图所示：
【1】
