背景介绍
混合谱系白血病（MLL）是一种急性白血病，通常预后不良，目前还没有有效的治疗方法。染色体是DNA与组蛋白的复合物，组蛋白共有五个主要家族，分别是 H1/H5、H2A、H2B、H3 和 H4。组蛋白赖氨酸的甲基化是组蛋白修饰的主要方式之一，在从转录调控到细胞分裂等的多种生物学过程中有着重要作用，甲基化过程的失调可能会导致肿瘤的产生和发展。 MLL1 是一种选择性催化 H3K4 甲基化的甲基转移酶，由位于染色体带11q23 的 MLL 基因编码而成。而染色体带 11q23 的易位是最常见的染色体易位之一，该位点的易位可以导致 MLL 基因与多种其它基因融合产生 MLL 融合基因。已发现的由 MLL 融合基因表达的 MLL 融合蛋白超过 100 种，但其中 MLL-AF9、MLL-ENL 和MLL-AF4 占所有 MLL 重排的三分之二以上。大部分的 MLL 融合蛋白是由 MLL1 氮端的部分与其融合伙伴的碳端部分融合，使其获得了其融合伙伴的部分功能。由于MLL融合蛋白不含 SET 结构域， 所以它丧失了 MLL1 的甲基转移酶的功能。MLL 融合蛋白激活下游基因表达的通路之一是招募另一种甲基转移酶 DOT1L 促使 MLL 靶基因位点 H3K79 的高度甲基化，进而引起 HOX、MEIS-1 等下游基因的持续表达，从而诱发混合谱系白血病（MLL）的发生发展。DOT1L 在 MLL 白血病的形成和发展中有重要作用，但因为DOT1L 是唯一已知的催化 H3K79 甲基化的甲基转移酶，在维持造血系统及多种器官的正常功能方面有重要作用，完全抑制 DOT1L 的功能有可能会产生多种副作用。故在此次课题中，设计的小分子化合物为阻断 DOT1L 与融合蛋白相互作用的选择性DOT1L 抑制剂。
研究意义
DOT1L 在 MLL 白血病的形成和发展中有重要作用，但因为DOT1L 是唯一已知的催化 H3K79 甲基化的甲基转移酶，在维持造血系统及多种器官的正常功能方面有重要作用，完全抑制 DOT1L 的功能有可能会产生多种副作用。故在此次课题中，设计的小分子化合物为阻断 DOT1L 与融合蛋白相互作用的选择性DOT1L 抑制剂。本项目的主要研究目的是在前期工作的基础上设计并合成能够阻断DOT1L与MLL融合蛋白相互作用的拟肽化合物，并对它们的作用机制及抗肿瘤活性进行研究，为新型抗肿瘤药物的研究提供新思路和新方法。
拟解决的问题
- 在前期工作的基础上合成有潜在性的小分子化合物，通过化学反应等手段将其加在已有的多肽片段上，验证该化合物与靶蛋白的相互作用。
- 对照已知的多肽片段，设计合成对靶蛋白可能有效的非天然氨基酸，再将之前合成的小分子化合物加在合成的片段上，验证其与靶蛋白的相互作用。
研究内容及方法
- 在众多致病的MLL融合蛋白中，本次课题选择从阻断MLL-AF9和DOTIL相互作用出发，根据已经报导的AF9与 DOT1L 形成的复合物的 NMR 结构，对 DOT1L 中与 MLL 融合蛋白结合的多肽片段进行结构优化和改造，发现能够阻断 DOT1L 与 MLL-AF9 的相互作用的小分子化合物。
- 在以前的研究中，Bushweller课题组通过 NMR 发现 DOT1L 可以通过三个多肽片段与 AF9 结合，其中结合能力较强的两个片段分别是片段 2（含 863-878 的氨基酸）和片断 3（含 876-900的氨基酸），在 DOT1L 中的片段 3 与 AF9 形成的复合物的 NMR 结构中，AF9 重组蛋白（含 499-568 的氨基酸）形成了三个 alpha; 螺旋和两个 beta; strand，而片断 3 中的 10 肽（aa879-888）形成了一个小的 beta;strand，其中 Val881 中的氨基和羧基及 Ile883 中的氨基和羧基分别与AF9 中一个 beta; strand 中的 Phe545 和 Phe543 的羧基和氨基形成 4 个氢键，另外Leu879、Val881、Ile883、Leu885、Val888 中的疏水性侧链则与 AF9 有疏水性相互作用，其它的氨基酸与 AF9 没有直接作用。Nikolovska-Colesk 的研究组曾对片段 2 中 10 肽进行过丙氨酸扫描，结果表明当Leu865、Ile867、Ile869、Leu871 这几个氨基酸被用丙氨酸替换后会导致蛋白结合能力下降超过 100 倍，而碳端的 Val874 用丙氨酸替换后蛋白结合能力仅下降了6倍左右。由于片段 2 和片段 3 中的两个 10 肽氨基酸序列高度类似，而且 NMR 显示两个片段与 AF9 的结合模式相同，因此扫描结果应该同样适用于片断 3 的 10 肽。
- 对多肽进行改造时，多肽的长度直接影响改造的难度，所以通常首先需要确定能保持蛋白结合能力的最短的肽。分析 NMR 结构及氨基酸扫描的结果，两个 10 肽中碳端的三个氨基酸对蛋白结合能力的贡献有限，根据这一结果我们截除了 DOT1L 十肽碳端的三个氨基酸，发现得到与 AF9 和 ENL 仍保持较强结合的能力7 肽。
通过7肽的结构进行修饰改造以发现良好的选择性DOT1L抑制剂。本次实验课题主要是对N端进行尝试改造，合成小分子结构片段1，通过固相合成将它们连接在已有的多肽片段上，验证该化合物与靶点的相互作用力，其次，为了克服多肽代谢稳定性差、生物利用度低等内在缺陷，根据原有多肽片段结构设计合成非天然氨基酸，再将结构片段1连接在非天然氨基酸所组成的化合物片段上，验证其可能的成药能力。
本项目的主要研究目的是在前期工作的基础上设计并合成能够阻断DOT1L与MLL融合蛋白相互作用的拟肽化合物，并对它们的作用机制及抗肿瘤活性进行研究，为新型抗肿瘤药物的研究提供新思路和新方法。
