一、研究背景
自从2019年12月大爆发以来，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）已造成全球范围内的大恐慌，确诊人数超过千万，死亡人数超过百万，经济损失达万亿元。为尽快遏制疫情扩散、防御病毒，研发疫苗刻不容缓、争分夺秒，研发新的抗病毒药物和疫苗是耗时耗力的。目前，已经上市的主要是生物疫苗，包括灭活疫苗[1, 2]，mRNA疫苗[3]、腺病毒疫苗[4]和重组蛋白疫苗[5]。尚无治疗COVID-19的特效药物，最佳办法是重新利用现有的广谱型抗病毒药物，针对关键的药物靶点进行药物筛选，改变已知药物的用途。因而需要对病毒的治疗靶点，尤其是对关键蛋白的结构有深入的认识。
引起COVID-19大流行的病原体是严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2），是一种新型的beta;冠状病毒[6, 7]，其正链RNA基因组全长约为30 kb，编码至少29种蛋白质，包括4种结构蛋白——刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N），和16种非结构蛋白（non-structural protein，nsp1-16）[8]。科学家们（具体到课题组，细化一下）使用冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography，cryo-ET）、X-ray晶体学以及子断层扫描图平均化（subtomogram averaging，STA）等技术，解析了病毒转录机器的复合物结构，解析了病毒高分辨率的原位结构信息，进而阐述了SARS-CoV-2复制和翻译的机制，以及病毒如何在管腔中寡聚、组织和包装其长链RNA[9]。基于此，鉴定了多种潜在的、重要的药物靶标，包括与病毒侵染宿主相关的S蛋白[10]、酶解多聚蛋白的3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶（也称为主蛋白酶，Mpro，或3CLpro）[11]和木瓜蛋白水解酶（papain-like proteinase，PLpro）[12]、催化RNA合成的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp，或nsp12）[13]等。
SARS-CoV-2的不连续转录对病毒在宿主细胞的复制至关重要。SARS-CoV-2进入宿主细胞后，释放其RNA基因组，利用宿主细胞的翻译机制，翻译多聚蛋白（pp1a和pp1ab）和必需的蛋白酶（Mpro和PLpro）。多聚蛋白随后被Mpro和PLpro切割成16个NSPs，这些NSPs形成转录-复制复合体（Replication and Transcription Complex，RTC），参与全长负RNA链的合成。由聚合酶nsp12、引物酶nsp8和辅因子nsp7组成“核心转录复制复合体”(C-RTC)[14]，解旋酶nsp13与C-RTC组装，形成延伸转录复制复合体”（E-RTC）[15]，其他nsp蛋白依次参与形成RTC，协助完成RNA链的延伸及加帽过程。COVID-19的基因组大，其下游的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）远离基因组的5′端，因此病毒还以不连续转录的方式产生一组嵌套的亚基因组RNA（subgenomic RNA，sgRNA），从而有效翻译这些ORFs，包括4种重要的结构蛋白[16, 17]。
冠状病毒的sgRNA合成受特定RNA基序的调控，即核心区域保守的转录调控序列（transcription regulation sequence，TRS），位于基因组先导序列的3rsquo;端（TRS-L）和每个ORF的5rsquo;端（TRS-B）[16]。在RTC延伸RNA链的过程中，当遇到TRS-B时会发生两种事件，忽略TRS基序，通读（reading through）继续合成sgRNA；或者发生模板转换（template switch），新生的负链RNA（cTRS-B）和先导区（TRS-L）配对，新生链合成结束，重新定位进而合成不同的sgRNA[18]。在模板转换发生时，会形成一个三链的中间产物[19, 20]，包括RNA模板（TRS-B）、新生的负链RNA（cTRS-B）和先导区（TRS-L）。我们希望通过解析RTC与RNA的复合物结构，阐明模板转换的分子机制，可以发现潜在的药物靶点。
二、研究意义
不连续转录对COVID-19在宿主细胞中的复制至关重要，产生一组嵌套的sgRNAs，用于合成病毒所需的各种蛋白，包括4种重要的结构蛋白。在合成sgRNA的过程中，发生模板转换的分子机制尚不明确。因此，本项目拟解决的科学问题是“阐明sgRNA合成过程中模板转换的分子机制”。
三、研究进展
目前已经获得使用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析（HiLoad 16/600 Superdex 200 pg）得到nsp7-nsp8复合物以及使用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析（HiLoad 16/600 Superdex 200 pg）得到nsp12蛋白的方法。
四、研究内容
