3-氯-5,6-二氢-1-(4-硝基苯基)-2(1H)-吡啶酮中的残留溶剂丙酮、叔丁醇、乙酸乙酯的检测方法开发及验证文献综述

一，拟研究问题

3-氯-5,6-二氢-1-(4-硝基苯基)-2(1H)-吡啶酮是合成阿哌沙班的重要起始物料，该物料合成过程中引入多种残留溶剂（丙酮、叔丁醇、乙酸乙酯）。在本次课题中，我们将使用气相色谱法，根据中国药典的药品质量标准分析方法验证指原则^[1]，建立合适的分析方法控制该物料的残留溶剂，并进行方法学验证。

二，研究手段

1.仪器及试药

2.限度的制订

丙酮属于第三类溶剂，参考中国药典2020年版四部通则0861“残留溶剂测定法”，将其限度订为不得过0.5%；

乙酸乙酯属于第三类溶剂，参考中国药典2020年版四部通则0861“残留溶剂测定法”，将其限度订为不得过0.5%；

经查阅文献（carcinogenic potency database），叔丁醇的TD50为64.6mg/kg体重/天。按照ICH M7指导原则，每日摄入量le; 64.6mg/kg/daytimes;50kgdivide;50000= 0.0646mg/day，计算限度le;0.0646mgdivide;10mgtimes;100%=0.65%。为了确保用药安全，并参考中国药典2020年版四部通则0861“残留溶剂测定法”，其结构相似物正丁醇、仲丁醇的限度均为0.5%，故将其限度订为不得过0.5%。

3.丙酮、叔丁醇、乙酸乙酯分析方法开发小结

本品中丙酮、叔丁醇、乙酸乙酯分析方法如下：

供试品溶液 取本品约50mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入N,N-二甲基甲酰胺2ml使溶解，密封。

对照品溶液 取乙酸乙酯、叔丁醇、丙酮适量，精密称定，用N,N-二甲基甲酰胺定量稀释制成每1ml中约含乙酸乙酯125mu;g、叔丁醇125mu;g、丙酮125mu;g的混合溶液，精密量取2ml置顶空瓶中，密封。

色谱条件 以6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷（或极性相近）为固定液的毛细管柱为色谱柱；起始温度为40℃，维持5分钟，以每分钟20℃的速率升温至190℃，维持4分钟；进样口温度为200℃。检测器温度为240℃；顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30分钟。

系统适用性要求 对照品溶液色谱图中，出峰顺序依次为丙酮、叔丁醇、乙酸乙酯，各峰之间的分离度均应符合要求。

测定法 取供试品溶液与对照品溶液分别顶空进样，记录色谱图。

限度 按外标法以峰面积计算，乙酸乙酯，叔丁醇和丙酮的残留量分别不得过0.5%，0.5%，0.5%。

1. 文献综述

阿哌沙班( apixaban) 是一种强效、口服有效的可逆、直接、高选择性 Xa 因子活性位点抑制剂，其抗血栓活性不依赖抗凝血酶Ⅲ。直接作用于凝血因子 Xa，用于治疗包括深静脉血栓和肺栓塞在内的静脉血栓疾病^[2]。临床研究表明，与每天皮下注射1次40mg依诺肝素相比，每天口服2次2.5mg阿哌沙班对预防髋关节或膝关节置换手术后静脉血栓栓塞事件疗效更佳，且不会增加出血风险。阿哌沙班合成过程中涉及的物料及产物多具有致突变杂质警示结构及含有多种残留溶剂，其可能涉及产品过程控制的全过程，包括起始物料、溶剂、催化剂、中间体、副产物和降解产物等。国家药监局于 2020 年 1 月 21 日发布《Q2 ( R1) : 分析方法论证: 正文和方法学》等 11 个国际人用药品注册技术协调会指导原则的公告( 2020 年第 7 号) ，人用药品注册技术要求国际协调会( ICH) M7^[3]将《评估和控制药物中 DNA反应性( 致突变) 杂质以限制潜在致癌风险》纳入其中，要求申请人自该公告发布之日起 6 个月后，开展的药学研究应符合 ICH 指导原则的要求。此外，根据药品杂质分析指导原则，残留溶剂作为杂质限量检查是质量控制指标之一^[4-5]。

阿哌沙班的合成路线

阿哌沙班的合成方法目前有很多相关的文献及专利报道，各路线均采用偶极加成反应-消除反应策略构建吡唑环，而不同路线中偶极受体( 化合物8)均一致，而偶极子结构略有差异。专利 CN101967145B ^[6]和 CN105732622B^[7]中合成路线见图 1，化合物7与化合物8发生加成反应后，消除一分子哌嗪得到阿哌沙班母核。专利 CN101065379B^［8］和文献^［9］中合成路线见图 2，化合物12与化合物8发生加成反应后，消除一分子氯化氢得到阿哌沙班母核。

路线2中的化合物12即为本次实验探究的3-氯-5,6-二氢-1-(4-硝基苯基)-2(1H)-吡啶酮。本实验重点讨论内容为此化合物合成过程中引入的残留溶剂：丙酮、叔丁醇、乙酸乙酯的分析方法的建立及方法学验证，包括检测限，定量限，线性与范围，准确度，进样精密度，重复性，耐用性等。

1. 参考文献

【1】《中国药典》2020版第四部，中国医药科技出版社，483-485.

【2】WANG L，ZHONG J F，SHI H L．Development of clinical re-search onapixaban，anoral direct inhibitor offactor Xa［J］．Shanghai Med Pharm J(上海医药) ，2012，33(17) : 17-20．

【3】ICH. Assessment And Control Of DNA Ｒeactive ( Mutagenic) Im- purities In Pharmaceuticals To Limit Potential Carcinogenic Ｒisk［EB/OL］． ［2020-05-08］． https: / /www． ich． org /fileadmin /Public _ Web _ Site/ICH_ Products/Guidelines/Multidisciplinary /M7 /M7_Ｒ1_Addendum_Step_4_2017_0331． pdf．

【4】EUROPEAN PHARMACOPOEIA[S].EIGHTH EDITION Volume1:2013 583-584.

【5】Hans-Joachim Kuss，Stavros Kromidas. 液相与气相色谱定量分析使用指[M]，北京：人民卫生出版社，2010：241-250.

【6】JI Y F，JIANG J A，LIU Q，et al． Method for preparing an-tithrombotic medicament apixaban: China，101967145B ［P］．2012-07-04．

【7】ZHAO J L，LI Z B，WANG Q． Method for preparing antithromboticmedicament apixaban: China，105732622B［P． 2017-07-11．

【8】SHAPIＲO Ｒ，ＲOSSANO L T，MUDＲYK B M，et al． Process forpreparing 4，5-dihydro-pyrazolo ［4-c］ pyrid-2-ones: China，101065379B［P］． 2011-05-11．

【9】WANG G，GUO Y K，ZHONG J F，et al． Graphical synthetic routes of apixaban［J］． Chin J Pharm (中国医药工业杂志) ，2012，43( 2) : 157-159．

资料编号：[372393]

一，拟研究问题

3-氯-5,6-二氢-1-(4-硝基苯基)-2(1H)-吡啶酮是合成阿哌沙班的重要起始物料，该物料合成过程中引入多种残留溶剂（丙酮、叔丁醇、乙酸乙酯）。在本次课题中，我们将使用气相色谱法，根据中国药典的药品质量标准分析方法验证指原则^[1]，建立合适的分析方法控制该物料的残留溶剂，并进行方法学验证。

二，研究手段

1.仪器及试药