课题背景：
紫杉醇（Paclitaxel,Taxol,PTX）是从红豆杉树皮中提取出来的具有独特抗癌活性的二萜类化合物。它能够与微管蛋白结合，促进微管蛋白聚合装配成微管二聚体，从而抑制细胞中微管的正常生理解聚，使细胞有丝分裂停止在G2期及M期，阻止了癌细胞的快速繁殖。主要适用于卵巢癌、和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部瘤、淋巴瘤、脑瘤也有一定疗效。然而紫杉醇药物在临床应用中难溶于水、毒副作用大以及生物利用率低等缺陷给它的使用带来了不便，尤其是静脉给药。因此，对于合成紫杉醇复合物以期改善紫杉醇上述缺陷的研究和实验已经成为医药科研工作者的艰巨任务。
传统的抗癌药物没有很高的选择性, 在杀死肿瘤细胞的同时, 对正常细胞也有一定的伤害, 因此靶向性抗癌药物成为当前研究热点。肿瘤细胞在生长过程中常伴有基因和蛋白的特异性变化, 这种变化不仅成为区分肿瘤细胞和正常细胞的重要标志, 也成为肿瘤治疗药物的良好作用靶点。利用这种途径研制出一系列肿瘤靶向药物, 如单克隆抗体等[3]。但细胞膜具有选择渗透性, 生物大分子药物无法通过细胞膜进入细胞内, 而存在于细胞外的药物很难直接影响细胞内的生物反应, 因此促进药物穿透细胞膜的研究变得非常重要。虽然有些药物可以通过化学修饰来提高渗透性, 但这需要通过繁冗试验, 以保证在不影响细胞活性的条件下实现穿膜的目的,人们迫切需要寻找一种更简便的途径促进药物穿透细胞膜[1] 。
1988年Green等[5]首次报道HIV的反式激活蛋白Tat具有穿透多种细胞膜的作用。随后, 一系列能够通过耗能或非耗能形式跨过多种细胞膜的小分子多肽(其长度一般不超过30个氨基酸)被发现, 并被命名为穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)[6]。但是直到1994年，TAT 才被应用在药物传输载体方向。Fawell 等[11] 发现TAT 能够携带与其通过共价键相连的大分子物质穿越多种组织器官。后来到1999 年，Dowdy 等人发现TAT-beta;-galactosidase 融合蛋白通过腹腔注射能够穿越血脑屏障。至此，CPPs强大的功能引起人们的重视，关于CPPs 介导的药物载体的研究成为药剂学研究的新兴方向。近些年的研究表明，CPPs 能够介导不同种类的大分子穿透生物体内多种生理屏障，包括皮肤屏障（透皮给药） [7] [8]、胃肠道屏障（口服给药）[9]、血脑屏障[10] 、肿瘤生理屏障等[2]。这种新兴的短肽结构载体不仅生物毒性相对较低，能够避免系统的免疫反应，而且运载效率高、应用灵活、适用范围广，具有优秀而全面的运载能力[4]。
到目前为止，已经发现并应用于药物载体的具有穿膜功能的多肽分子有很多。这些不同的穿膜肽在化学结构上存在较大差异，所有这些多肽的共同点是它们都含较多的精氨酸与赖氨酸，这些带正电荷的氨基酸残基可能是CPPs 具有穿膜活性的结构基础 [2] 。对于穿膜肽穿膜机制的研究目前尚没有确切的定论 [12] 。穿膜肽上均表现出很强的正电荷，这些正电荷能够通过静电作用与细胞膜相互作用，这种静电作用与穿膜肽的穿膜功能是密切相关的。根据穿膜肽的来源主要分为3 类：首先是来源于蛋白的CPPs，如TAT、Penetratin、pVEC 等，这类多肽通常含有转运蛋白最小有效片段；其次是模拟CPPs，如MAP、(Arg)7 等，这类多肽是通过模拟已知穿膜肽的结构进而人工合成的；最后一类是人工设计合成CPPs，如Transportan、MPG 等，这类多肽一般是由一端亲水一端疏水组成的嵌段多肽。其中，研究较多的是TAT和寡聚精氨酸，但两者在应用上都面临着一些缺陷：TAT来源于HIV病毒，安全性尚待长期考察；寡聚精氨酸对细胞毒性较强，对其修饰以减少毒性的工作也还未能有突破。因此，迫切需要寻找一个来源广泛、安全，制备工艺简单，且能够大规模生产的穿膜肽。
图 1 细胞穿膜肽在药物运载中的应用
Figure 1 Applications of Cell penetrating peptides in Cargo delivery
穿膜肽A（cell penetrating peptide A, CPPA）是一种富含精氨酸的穿膜肽，它是由FDA 批准的天然蛋白硫酸盐经酶解而得到的较小片段，其分子量为1.8 kDa。CPPA包含了能够结合肝素的结构域，较天然蛋白来说，具有无免疫性、无毒性的优点。同时序列中部分片段与TAT相似，深入研究后发现，CPPA具有与TAT相似的穿膜性质。纳米给药系统采用CPPA修饰后能够显著促进其细胞穿透性。CPPA已经在基因给药系统和脑内靶向给药中得到了应用。CPPA相对于其它穿膜肽的优势不仅表现在其来源于天然药物鱼精蛋白，安全易得，而且成本较低，可以规模化生产以适应实际应用需求。因此，CPPA是一个不可多得的穿膜肽，应用于给药系统的设计有望提高大分子药物的生物利用度。
课题目的：
紫杉醇（Paclitaxel）作为抗癌药物，为了进一步提高紫杉醇对肿瘤组织内部的渗透作用，增加生物利用率，对共价合成的紫杉醇-穿膜肽复合物Paclitaxel-CPPA进行体内外评价。通过体外细胞摄取实验以及体内药效学评价来验证Paclitaxel-CPPA的有效性。
