开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究背景
1.1肿瘤免疫治疗
肿瘤免疫治疗是通过调动机体的免疫系统，增强抗肿瘤免疫力，达到抑制和杀伤肿瘤细胞效果的一种肿瘤治疗方式，具有治疗多种类型肿瘤的潜力，是当前肿瘤治疗的发展趋势[1]。21世纪以来，各种肿瘤免疫疗法进入人们的视野。2003年，确定了肿瘤特异性T细胞的存在，并揭示了免疫系统可以特异性识别肿瘤细胞并控制其生长的重要作用[2] ；2010年，人类历史上第一支肿瘤疫苗Sipuleucel-T (商品名:PROVENGE)经FDA批准用于前列腺癌的治疗；2011年，靶向免疫检查点CTLA-4的单克隆抗体抑制剂Ipi- limumab被FDA批准用于晚期黑色素瘤的二线治疗，肿瘤免疫治疗进入了快速发展的新时代[3]。近几年，肿瘤免疫治疗己成为肿瘤治疗的研究热点和希望，包括抑制PD-1/PD-L1通路的K药（Pem- brolizumab）和O药（Nivolumab）获得FDA批准，用于晚期黑色素瘤和晚期鳞状非小细胞肺癌的治疗，都让我们看到了战胜肿瘤的希望。
1.2免疫检查点VISTA
T细胞是机体免疫系统抗肿瘤免疫应答的核心,各种免疫疗法最终目的都是激活自身T细胞免疫应答,对肿瘤进行特异性杀伤及清除。T细胞激活为双信号活化模式，第一信号——抗原肽-MHC 复合物与T细胞表面受体结合；第二信号——抗原呈递细胞上协同刺激分子与T细胞表面相应受体的结合。第二信号按功能可分为: 共刺激分子和共抑制分子[4]。共抑制分子( co-inhibitory molecules)是表达在不同免疫细胞表面的受体分子,通过负向调节免疫细胞的活化和效应机制,保证免疫应答在适当的强度和时限，维持机体免疫稳态，因此又称为免疫检查点(immune check- points )[5]。前文中提到PD-L1、PD-1、CTLA-4均为免疫检查点，此外还有LAC-3、VISTA、TIM-3、CD155等。 VISTA是一种新发现的共抑制分子，又称PD-1H ,其编码基因位于小鼠第10号染色体[6]。VISTA 蛋白属于B7超家族的成员之一,是一种跨膜蛋白，由胞外结构域、跨膜结构域及胞内结构域组成，主要表达于胎盘等造血组织及周围浸润的白细胞中，在单核细胞、中性淋巴细胞、T细胞中高表达[7]。然而，目前对VISTA介导的胞内信号转导机制尚不明确。
VISTA作为新发现的靶标分子,在T细胞免疫抑制方面有明确的功能,而且VISTA与PD-1有着不同的信号通路,动物实验已表明联用PD-1抑制剂可达到更好的肿瘤杀伤作用, 且不良反应轻[8]；在肿瘤微环境和肿瘤浸润淋巴结中VISTA的表达升高,VISTA的封闭可阻碍肿瘤的生长,当VISTA mAb与肿瘤疫苗联用时,治疗效果更加明显[9]；肿瘤细胞可还通过VISTA信号活化引起的DC-CIK免疫反应的负调节发生免疫逃逸,抗VISTA抗体与其抗原结合后可促进外周血中特异性肿瘤T细胞的增殖，并增强其在肿瘤微环境中的渗透能力、杀伤活性[10]。以上研究结果均提示我们VISTA靶点的封闭或与其他免疫检查点抑制剂联用可能成为肿瘤免疫治疗的新方法。
1.3活性评价方法
目前, 绝大多数上市或处于临床研究阶段的抗肿瘤免疫药物都是通过阻断T细胞的共抑制分子。因此, 淋巴细胞的增殖与活性水平的检测是细胞免疫功能研究的常用方法, 也是目前抗肿瘤免疫药物研发中一个重要的考察指标[11]。
在筛选初期应用的生物化学检测法经常涉及到配体与受体的结合,包括在细胞内环境、细胞表面或抑制酶催化反应，这种方法最适用于检测具有确定疗效的先导化合物[12]。本实验将利用ELISA方法检测实验条件下PBMC的细胞因子分泌情况，从而了解细胞活性水平，并初步评价备选化合物与VISTA的结合情况。
对于需要诱导细胞增殖的实验可以直接用细胞增殖检测法进行药物筛选。其中常见于报道的细胞增殖和活性水平通常结合流式细胞仪、时间分辨荧光检测仪等自动化设备，而较常用的细胞标记方法则有3H-TdR掺入法、MTT法、MTS法等，其中3H-Td R掺入法需要进行同位素标记，对操作安全和设备管理有着较高的要求。MTT/MTS法则是以细胞的数量来反应增殖的变化, 不能反应细胞的分裂情况, 并不能完全满足部分实验的需求。而CFSE染色是一种有效的检测淋巴细胞分裂与增殖的方法。它标记的荧光可平均分配到两个子代细胞中, 出现连续的荧光强度递减现象[13]。因此, 本实验也将采用CFSE标记法结合流式细胞术检测PBMC细胞分裂与增殖的活性，反过来验证VISTA抑制剂的抗肿瘤活性，为探索肿瘤免疫药物的活性提供有效的评价方法。
