开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 课题背景
苹果酸酶1（ME1）调节提供烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的主要途径之一，其通过维持细胞质中的氧化还原平衡和生物合成过程，对癌细胞生长起着至关重要的作用。研究发现，抑制ME1会破坏癌细胞的代谢，并通过诱导衰老或凋亡来抑制癌细胞的生长。在葡萄糖限制性培养条件下，ME1在癌细胞中表达增加。此外，对葡萄糖限制条件下，与正常培养条件相比，癌细胞对于删除ME1的敏感性更高。以上表明在低糖环境，也就是糖酵解和磷酸戊糖途径（PPP）减弱，癌细胞依赖于ME1供应的NADPH和丙酮酸。ME1是癌症的有希望的靶标治疗，以及使用ME1抑制剂结合抑制糖酵解，PPP或氧化还原平衡调节剂的策略可提供一种有效的治疗选择。
苹果酸酶负责氧化脱羧苹果酸盐到丙酮酸盐，这是体内最基础的支持三羧酸（TCA）循环的底物。在人体细胞中，苹果酸酶由三个同源基因编码，包括ME1，它位于细胞质，维持酶活性需要NADP;ME2，位于在线粒体，维持酶活性需要NAD;和ME3，位于线粒体，维持酶活性需要NADP。这些酶广泛分布于自然，且其具有高度保守的序列，在不同物种间具有类的拓扑结构，这表明它们具有重要的生物功能。
和ATP一样， NADPH具有同样重要的作用，它为氧化还原防御提供动力并减少生物合成。肿瘤细胞重编程其代谢模式为了满足快速细胞增殖的需要从而产生了过量产生的活性氧（ROS），这需要大量的NADPH补充剂。通过回收TCA中间体苹果酸进入普通碳源丙酮酸，苹果酸酶可能在满足细胞方面具有调节作用减少等效物，能量和生物合成前体的需求。苹果酸酶对NADPH的产生至囧=关重要来自氧化戊糖磷酸途径和谷氨酰胺代谢，因此被评估为治疗目标。据报道，ME1产生NADPH的水平与G6PD产生的水平一样并在高磷酸戊糖途径分流。抑制ME1或ME2会导致新陈代谢改变，细胞生长减少、迁移，鼻咽癌和非小细胞肺癌中ROS水平升高。
在恶性肿瘤中，可反复观察到点突变、易位、基因扩增和缺失等致癌基因的改变，癌基因及其下游信号已成为肿瘤治疗的靶点。近几十年来，癌症细胞通过改变细胞代谢来适应基因和微环境的改变来维持生长和生存，这一点已经变得很清楚了。因此，靶向细胞代谢的重新编程来治疗癌症目前已成为人们关注的焦点。肿瘤相关代谢重编程影响基因表达、细胞分化和肿瘤微环境，巴甫洛娃NN等人最近将这些特征总结为癌症代谢的六大特征。其中一个特点是利用糖酵解和三羧酸(TCA)中间体进行生物合成和生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。NADPH在细胞中起还原剂的作用，在大分子生物合成和氧化还原平衡中具有重要作用。NADPH是由戊糖磷酸途径(PPP)的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)、苹果酸酶(MEs)、异柠檬酸脱氢酶(IDHs)和单碳四氢叶酸氧化途径中的酶等代谢酶产生的。这些nadph产生酶已被评估为癌症的潜在治疗靶点。MEs通过将TCA循环中间苹果酸转化为TCA碳源丙酮酸和NADPH，调节细胞能量、氧化还原平衡和生物分子合成。在哺乳动物细胞中，已鉴定出三种MEs亚型:一种胞质NADP -依赖的ME1 (ME1)亚型;线粒体NAD 依赖亚型ME2 (ME2);线粒体NADP 依赖亚型ME3 (ME3)。与线粒体ME2和ME3不同，ME1在细胞质中产生NADPH。据报道，ME1产生NADPH的水平与PPP分流术中G6PD产生NADPH的水平一样高。 ME1水平的主要细胞来源，被用作癌症放疗的预后和预测标志物。因此，ME1被认为是一个很有前途的癌症治疗靶点，并已被评估。在本研究中，我们通过分析ME1基因表达和代谢产物水平的变化，检测癌细胞对ME1抑制的易感性，探索ME1作为癌症治疗的靶点。
细胞溶质异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）的突变是原发性人脑癌的主要子集的共同特征。这些突变发生在IDH1活性位点的单个氨基酸残基处，导致酶催化异柠檬酸转化为alpha;-酮戊二酸的能力丧失。然而，只有单个拷贝的基因在肿瘤中发生突变，提高了突变不会导致功能简单丧失的可能性。在这里，我们显示癌症相关的IDH1突变导致该酶催化alpha;-酮戊二酸依赖于NADPH依赖性还原为R（2）-2-羟基戊二酸（2HG）的新能力。结构研究表明，当精氨酸132突变为组氨酸时，活性位点中的残基转移以产生与异柠檬酸的氧化脱羧减少和获得将alpha;-酮戊二酸转化为2HG的能力相一致的结构变化。已显示2HG的过量积累导致具有2HG代谢的先天性错误的患者中恶性脑肿瘤的风险升高。同样，在携带IDH1突变的人类恶性神经胶质瘤中，发现2HG水平显着升高。这些数据表明IDH1突变导致肿瘤代谢产物2HG的产生，并且表明在体内积累的过量2HG有助于神经胶质瘤的形成和恶性进展。
细胞溶质异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）及其旁系同源物线粒体IDH2是同型二聚体代谢酶，其通过MgO - 和NADP（H）依赖的异柠檬酸和alpha;-酮戊二酸的相互转化起作用。 IDH1（精氨酸132，R132）中的杂合体细胞错义突变发生在多种癌症中，包括神经胶质瘤，急性髓性白血病，胆管癌和软骨肉瘤。这些突变和IDH2中的类似突变赋予新形态酶功能，促进alpha;-酮戊二酸转化为R-2-羟基戊二酸（2-HG）的NADPH依赖性转化。 2-HG在肿瘤中积聚，其中它干扰一系列需要结构相似的alpha;-酮戊二酸作为共底物的酶。这些2-HG调节的酶中有一些是调节表观遗传状态和细胞分化的几种酶，为突变IDH酶如何促进肿瘤发生提供了一种机制。因此，通过小分子突变体IDH1和IDH2抑制剂阻断2-HG产生正在成为有希望的治疗策略。值得注意的是，与野生型（WT）IDH1，WT IDH2和IDH2的体细胞癌突变体相比，所有公开的突变体IDH1抑制剂对R132突变体具有选择性。实现癌基因功能的抑制而几乎没有抑制相应的WT蛋白是非常期望的特性，很少有肿瘤学治疗剂获得，并且在WT蛋白的抑制具有限制治疗功效的负担的情况下具有显着的重要性。了解使用小分子抑制剂可以实现突变体选择性的背景可能有助于我们了解如何产生具有改善的治疗指数的更好类别的药物。
ME1与IDH1代谢通路中可发现其催化特点有一致性，ME1在催化苹果酸生成丙酮酸的同时，催化NADP 转化为NADPH,在突变型IDH1/2催化异柠檬酸产生2-HG时，也存在这样的过程。因此，拟采用表达纯化蛋白结晶的思路解析其抗癌机制。
- 研究方法
- 获得目的基因
设计引物并聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）PCR，琼脂糖凝胶电泳回收目的基因。
- 构建含目的基因的质粒
采用酶切酶连或同源重组的方法
