| 开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 痘痘、痤疮一直是困扰青少年最大的皮肤隐患，抗痘也一直是热门话题，关于抗痘方面的的研究也数不胜数。但经查阅文献后发现，我国祛痘研究主要是从清洁疏通毛囊、调节皮肤物理状态、添加抗生素杀菌等预防和祛痘，但并未能解决抗痘痘、痤疮这个难题。 本课题将从维系皮肤常在菌平衡角度研究祛痘，在国外已有很多关于皮肤菌群与痤疮、痘痘的研究，而针对中国年青人健康皮肤和痘肌的常在菌的研究几乎没有。由于皮肤表面的菌群受人的地理环境、日常生活习惯的影响很大，也就意味着有必要了解中国年轻人群健康肌肤和痘肌在常在菌之间的差异。本课题将从中国药科大学同学的肌肤研究开始积累数据，为今后的进一步研究做准备。 将从药大学生健康肌肤和痘肌上采集细菌标本，用高通测序技术和16S rRNA测序技术对肌肤常在菌的种类和数量之间的差异进行数据分析，分离菌群培养，向培养基中分别加入灭活的益生菌菌体以及灵芝、茯苓等对肠道菌群有调节作用的中药材，记录数据，分析并筛选出对肌肤菌群有理想作用的目标物质。 皮肤常在菌与痘痘研究综述 前言 从皮肤菌群、益生菌、皮肤微生态与痘痘等关键词查阅文献，并总结与皮肤常在菌与痘痘课题相关的文献。皮肤表面微生物存在生态平衡，若菌群紊乱将会导致痤疮、特应性皮炎、黄褐斑等皮肤病。从维系皮肤常在菌的生态平衡是一个新的抗痘途径，因为很难向化妆品中加入活菌，将探讨灭活的益生菌菌体以及灵芝、茯苓等对肠道菌群有调节作用的中药材对皮肤表面菌群的影响。 地球作为一个大的生态系统，不仅有生物多样性，而且有环境多样性，不同生物之间，不同环境与物种之间每时每刻都进行着物质交换和能量流动，相互作用、相互影响，共同维持着地球的生态平衡。同理，皮肤也可以被看作是一个生态系统。从生物多样性的角度来说，痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌、棒状杆菌、马拉色菌等微生物共同组成皮肤微生物的多样性。活跃在皮肤表皮的细胞，如角质形成细胞、黑色素细胞、朗格汉斯细胞等共同构成皮肤细胞的多样性。[1][1] 皮肤表面微生物之间存在互惠共生、互相拮抗的关系[2][2]。可通过影响调节菌群，探究菌群之间互相影响的方式，以及寻找一些药用物质来调节皮肤微生态平衡，来达到抗痘的目的。有研究细菌通过释放细菌胞外囊泡（EVs）具有促炎作用，痤疮丙酸杆菌衍生的细胞外囊泡能够通过增加角质形成细胞的增殖，在体外模型中诱导成痤疮样模式。而来自人类微生物群的不同微生物产生的细菌胞外囊泡之间存在相互干扰[3][3]。可通过寻找合适的菌，其衍生物能对面部菌群产生有益的影响，从而改善痘痘、痤疮。 1、皮肤常在菌 皮肤是隔离人体内环境与外环境的第一道屏障，成人的皮肤总面积约为1.5~2.0m 。虽然低温、干燥、高盐、偏酸、存在抗菌肽以及皮屑脱落等皮肤环境，不利于微生物的生长繁殖，但在人类皮肤上仍有约104~109个/cm2的微生物存在。根据不同微生物在皮肤表面定植的时间长短，可将其分为常驻菌群与暂驻菌群。 1.1皮肤常驻微生物种类 皮肤常驻菌：正常人出生后不久,皮肤即附有细菌,其中一部分菌群能长期在皮肤 生长繁殖 ,我们称之为皮肤的常住菌，如表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、 座疮丙酸杆菌等是皮肤主要的常住优势菌。 皮肤暂住菌：菌群是暂时着落于皮肤上的,经过一定时期后,可从皮肤消失,我们称之为皮肤暂住菌,包括金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus，S.aureus，金葡菌)、革兰氏阴性菌（Gram-negative）及一些产色素微球菌等。[4][4] 1.2皮肤微生物差异 影响皮肤微生物最主要的因素是环境，但是环境是非常复杂多变的影响因素。首先，定植宿主具有较强的个体差异性，不同的基因型、年龄、性别、生活环境、生活习惯、抗生素的使用情况等各不相同。[5][5] 例如： ·革兰氏阴性菌则适宜在低温高湿的皮肤环境中增殖，并且在不同纬度及海拔地区，因紫外线照射强度不同，细菌增殖的情况也会不同。不同单一个体之间，常驻菌群的差异性也很大。[6][6] ·研究发现，在人面部油脂分泌旺盛部位，微生物的多样性较低，一般只会发现少部分特定细菌。葡萄球菌和丙酸杆菌是这些部位的优势菌。而在人体皮肤相对干燥的部位，微生物菌群结构的多样性反而更高。在人前臂、腰部、手部等这些干燥皮肤的区域，菌群的复杂程度往往高于同一个体的肠道与口腔。[7][7] 1.3皮肤微生态与皮肤病 皮肤表面的微生物、宿主及外环境三者的相互作用形成了皮肤微生态环境。影响皮肤微生态平衡的因素很多，如皮脂腺浓度、水分含量、温度，以及遗传和环境因素等。生态平衡被打破时，可引起脂溢性皮炎、痤疮等皮肤问题。 ·研究认为引起痤疮的主要致病菌是毛囊皮脂单位中的常住菌痤疮丙酸杆菌。在青少年面部毛囊皮脂腺的成熟过程中，往往会有许多亲脂性微生物定植，分泌大量脂肪酶、蛋白酶和透明质酸酶，使正常组织受损，引起局部感染和炎症发生，最终形成面部痤疮。[8][8] 通过调整皮肤菌群失调恢复微生态平衡，可较有效治疗寻常型痤疮。 2、皮肤微生态平衡 2.1化妆品中应用 皮肤微生态的平衡是由皮肤不同微生物群落间，皮肤微生物与宿主之间持续不断相互作用来实现平衡的，这一平衡的维持对皮肤健康十分重要。有不少品牌的产品或通过调节皮肤微生物组的组成，或提供促进皮肤有益共生菌生长的微环境等达到维持、改善或促进皮肤健康的目的。可在化妆品中添加益生菌的碎片或萃取物，通过影响皮肤微生物组，达到改善皮肤健康的目的。[9][9] 2.2微生态失调 菌群之间存在共生或拮抗作用，参与表皮脂质膜的形成，皮肤有维持微生态平衡的能力，如果宿主的皮肤、环境和菌群之间处于不协调状态即微生态失调，就会造成皮肤的病理损害。痤疮是典型的微生态失调引起的内源型炎症。调查发现痤疮患者皮损区的痤疮丙酸杆菌、产色素微球菌及需氧革兰氏阴性菌数量均高于健康皮肤。这是由于当皮脂腺分泌旺盛时，表皮的皮脂增多，微生物在毛囊中生长导致脂类积累而形成脂栓并堵塞，当毛囊完全堵塞时,痤疮丙酸杆菌在这种营养丰富且氧分压低的环境中迅速繁殖，即形成粉刺。[10][10] 皮肤微生态的研究可以为化妆品配方的功效、安全性评估提供新的研究切入点和新视角，同时也可为化妆品配方体系的开发提供新的观念和方向，其研究成果将具有广阔的应用前景。 3、皮肤益生菌 3.1益生菌种类 科学家目前 己发现的益生菌大致可分为三大类 , 其中包括 : A．乳杆菌类 (如嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、 詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)PM-A0006等等) ; B．双歧杆菌类 (如长双歧杆菌(B.longum)、短双岐杆菌（Bifidobacterium）等等) C．革兰氏阳性球菌 (如粪链球菌（Enterococcus faecalis）、乳球菌、中介链球菌等等) 。 此外,还有一些酶和酵母菌亦可归入“益生菌”范畴。 通常,应用于人体的益生菌有双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌 、枯草杆菌、腊样芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌 、酵母菌等。 3.2益生菌营养素 保护皮肤益生菌对于维持皮肤结构和功能的完整性是非常必要的。最有效的方法是通过提供益生菌的营养素来增强皮肤表面的益生菌群,即通过为益生菌补充食品及营养,促使益生菌生长和保持平衡,强化益生菌群,即使皮肤的天然平衡被破坏,此种营养素也能够帮助益生菌迅速恢复,使益生菌相对于有害菌更有优势,争夺营养,从而间接抑制有害菌,形成皮肤保护屏障,阻止有害菌的侵入,从而对致病菌的定殖产生拮抗作用。[11][11] 在抗痘的应用中长期加入抗生素会破坏皮肤表面的菌群平衡，可在产品中加入益生菌营养酵素，在抑制有害病原菌的同时可促进有益菌的生长，可起到竞争性保护作用，能提高祛痘产品的功效。 3.3益生菌代表及作用 近年来随着对益生菌研究的逐渐深入，发现以乳酸杆菌与双歧杆菌为代表 的益生菌，不仅具有抑制病原菌繁殖的能力，还具备提高宿主自身免疫力，增强宿主对致病菌侵袭的抵抗力。研究发现，乳酸菌能够产生大量的有机酸，这种有机酸可以降低环境pH值，抑制致病菌的繁殖，同时环境pH值 的降低也能够激活巨噬细胞、提高机体免疫功能、增强局 部抗感染能力。乳酸菌还可产生过氧化氢、抗菌肽和细菌 素，其对病原菌也会产生明显的抑制作用。因此，在临床应用中，乳酸菌有望在将来成为一种温和的杀菌剂。目前，在欧美已经出现一些益生菌护肤品，专门针对湿疹、 痤疮和敏感肌肤问题，使用后可使皮肤敏感性、炎性痤疮等问题得到明显改善。通过皮肤微生态的调节，使得皮肤疾病得到改善，对远期皮肤抗衰老与面部年轻化也起到了卓越的贡献。[5] 4、中药材和菌群平衡 人体肠道内有大量的微生物包括有益菌、有害菌和中性菌，其中有益菌的益生作用主要是通过直接或者间接调整宿主肠道微生物的组成，激活宿主内源性 微生物群或免疫系统的活性来实现。在些中药可以调节肠道菌群，现已有研究证明。 bull;胡丽萍通过羧甲基化改性获得羧甲基灵芝孢子粉，再经酶降解获得羧甲基灵芝孢子低聚糖，研究发现其能促进双歧杆菌的增殖。[12][12] bull;杨开等人通过添加灵芝孢子粉低聚糖进行体外发酵，发现不仅能够提高双歧杆菌属、乳酸杆菌属等有益菌的相对丰度，而且抑制大肠杆菌属丰度。[13][13] bull;茯苓，有实验研究结果证明[14][14], 党参能提高肠道内乳杆菌的水平, 同时降低有害菌大肠杆菌的水平;茯苓能有效提高双歧杆菌的水平。 bull;猪苓，有实验表明,猪苓提取液对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用,且抑菌作用随着浓度的增加而增强。通过比较抑菌圈的大小可知,猪苓提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最强,其次是金黄色葡萄球菌,大肠杆菌的抑菌效果最弱。[15][15] 这些研究都可以证明菌类中药会对肠道菌群有调节作用，那么这些中药材是否对皮肤表面的菌群同样有调节作用、将会对皮肤表面产生怎样的影响，将会在未来的实验中探究。 5、测定和分析方法 5.1面部细菌采集鉴定方法 标本采集：①病人样本用生理盐水清洗面部0.5 h 后使用磷酸盐缓冲生理盐水( PBS 液) 浸 湿棉拭子，于黄褐斑皮损区( 1 cm times; 1 cm) 由内向外 稍用力涂抹，采集后立即将棉拭子用无菌剪剪下，置盛有3 ml灭菌输送液的试管中，用无菌瓶盖盖紧，将试管带回实验室内。 ②健康成人标本，如前法于 双侧面颊部1 cm times;1 cm 范围内采集。 定量稀释：以PBS 液按10 倍稀释法稀释至 10 －1 ～10 －6。 接种和培养：使用 TSA（葡萄球菌选择培养基）、 BA、 PES 选择和非 选择性培养基，用机械旋转分开， TSA 平板培养基置 厌氧箱中培养，PES、BA 平板培养基为需氧培养，37℃分别于24、 48 h 后观察结果并计数。 分纯和鉴定：从TSA平板培养基上挑取 3 ～5 个特殊性菌落，一式两份接种到 TSA 和 BA 平 板培养基上，一份置厌氧培养，一份置需氧培养，2 ～ 5 次需氧对照不生长的菌株为厌氧菌株。再用微量 生化板( 浙江军区后勤部卫生防疫检验所提供) 及 SP2305 型气相色谱仪( 北京分析仪器厂制造) 作生 化性状和代谢产物分析，菌株初步鉴定到种。需氧菌分纯后按常规生化鉴定到种。[16][16] 5.2利用蔗糖选择性增强表皮葡萄球菌 表皮葡萄球菌（S）可以利用甘油发酵产生短链脂肪酸（SCFAs），这种脂肪酸具有抑制痤疮生长的抗菌活性。选择蔗糖为选择性引发剂（SFI），可以特异性增强S表皮的发酵活性，但不会增强P（痤疮丙酸杆菌）的发酵活性。 在蔗糖存在的情况下，痤疮假单胞菌和表皮葡萄球菌的共培养显著降低了痤疮假单胞菌的生长。[17][17] 5.3 16S rRNA测序技术 16S rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。数据库的不断完善，应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。该技术主要有三个步骤：首先是基因组DNA的获得，其次是16S rRNA基因片段的获得，最后是进行16S rRNA基因序列的分析。 5.4高通量测序分析： 又称下一代测序技术或深度测序，一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌分析成为可能。单样本的菌落总数须达到一定的浓度才可用于高通量测序（需 106 cfu~107 cfu 以上） 传统的微生物鉴定方法只能对可培养的菌种进行形态、生理生化鉴定，只能研究特定的微生物，无法对皮肤微生物菌群的多样性和丰度进行分析，具有很大的局限性。而寄居在皮肤上的微生物菌群相互作用，并与宿主、环境之间保持协调的、生理的、动态的平衡，这种平衡就是微生态平衡。功能纺织品包括现在市场上普遍出现的抗菌袜产品在预防病原体、保持皮肤清爽干净的同时，人们也会担心抗菌剂是否会打破皮肤的微生态平衡[18][18]。可运用高通量测序技术对其中的微生物多样性和丰度进行测序分析。 总结 由上可知从肌肤表面菌群微生态失调，将会导致痘痘、痤疮，调节恢复菌群平衡，可从细菌之间的相互作用入手。从细菌之间的相互促进与拮抗作用，可以通过加入细菌衍生物以及菌体对菌群平衡产生作用，本课题将会从灭活的益生菌菌体以及灵芝、茯苓等对肠道菌群有调节作用的中药材中筛选出对调节肌肤菌群有理想作用的物质. |
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