开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
琥珀酸美托洛尔缓释胶囊的有关物质方法开发
- 研究背景
1.药品信息
美托洛尔是全球首个beta;1的选择性（心脏选择性）肾上腺素能受体阻断剂，临床用于高血压、心绞痛、心律失常等及伴有左心室收缩功能异常的症状稳定的慢性心力衰竭。于1969年在瑞典的Hassle实验室研发成功。国内广泛应用琥珀酸美托洛尔缓释片倍他洛尔。琥珀酸美托洛尔缓释胶囊是根据缓释片改剂型开发的品种。胶囊剂与片剂相比，其在胃肠道中崩解较片剂快，吸收更好且对肠胃的刺激较小。这意味着琥珀酸美托洛尔缓释胶囊有着良好的市场前景。
本品主要成份为琥珀酸美托洛尔。化学名称：1-异丙氨基-3-[对-(2-甲氧乙基)苯氧基]-2-丙醇L( )-琥珀酸盐。
- 药品中有关物质检测的意义
有关物质，其正确的定义是:有关物质主要是在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中的降解产物等。
有关物质研究是药品质量研究中关键性的项目之一，其含量是反映药品纯度的直接指标。对药品的纯度要求，应基于安全性和生产实际情况两方面的考虑，允许含限定量无害的或低毒的共存物，但对有毒杂质则应严格控制。毒性杂质的确认主要依据安全性试验资料或文献资料。与已知毒性杂质结构相似的杂质，亦被认为是毒性杂质。
各国药典均未收载琥珀酸美托洛尔缓释胶囊的质量标准，未见琥珀酸美托洛尔缓释胶囊有关物质检测方法。
- 杂质列表
EP9.0和BP2019中提到的琥珀酸美托洛尔原料药有12个杂质，下面以BP2019药典标准中杂质情况为例进行列表说明：
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杂质名称 |
结构 |
杂质来源 |
备注 |
|---|---|---|---|
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琥珀酸美托洛尔 |
主药 |
N/A |
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杂质A |
起始物料引入 |
一般杂质，le;0.1% |
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杂质B（对应进口注册标准杂质H93/12） 对甲氧乙基苯酚 |
起始物料引入 |
一般杂质，le;0.1% |
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杂质C （对应ChP2015酒石酸美托洛尔杂质I，进口注册标准杂质H128/80） |
降解杂质 |
EP：特定杂质， le;0.15%； USP一般杂质le;0.1%； 进口注册标准：特定杂质le;0.2%。 |
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杂质D |
中间体 |
一般杂质，le;0.1% |
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杂质E |
起始物料引入 |
一般杂质，le;0.1% |
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杂质F |
起始物料引入 |
一般杂质，le;0.1% |
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杂质G |
起始物料引入 |
一般杂质，le;0.1% |
|
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杂质H |
起始物料引入 |
一般杂质，le;0.1% |
|
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杂质J |
中间体 |
一般杂质，le;0.1% |
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杂质M |
中间体 |
特定杂质，le;0.2% |
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杂质N |
中间体 |
特定杂质，le;0.2% |
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杂质O |
中间体 |
特定杂质，le;0.2% |
- 各国药典中收载的琥珀酸美托洛尔原料药关物质检测有2个方法：
- 有关物质1：薄层色谱法，检测杂质M、N和O。由于杂质M和N的紫外吸收弱，杂质O由于保留强，故杂质M、N和O采用薄层色谱法；
（2）有关物质2：检测除杂质M、N和O以外的杂质，采用液相色谱法。
本文中主要介绍有关物质2（除杂质M、N和O）的液相色谱法开发的方案。
表1-1 各国药典有关物质（除杂质M、N和O）检测方法（HPLC-UV）列表
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名称 |
BP2019[1]/EP9.0[2]（琥珀酸美托洛尔/酒石酸美托洛尔） |
ChP2015[3] （酒石酸美托洛尔） |
USP42（test 2）[4] (琥珀酸美托洛尔) |
USP42[5] （琥珀酸美托洛尔缓释片） |
琥珀酸美托洛尔缓释片进口注册标准JX20170108[6] |
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色谱柱 |
封端C18柱 （150mm*3.9mm，5micro;m） |
C18柱 |
C8柱 （125mm*4mm，4micro;m） |
C8柱（125mm*4mm，4micro;m） |
C8柱（推荐Lichrospher 60 RP-Select B，125mmtimes;4.0mm，5micro;m） |
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流动相 |
3.9g醋酸铵到810mL水中，加入2.0mL三乙胺，3.0mL磷酸，10.0mL冰醋酸和146mL乙腈，混匀。 |
醋酸盐缓冲液（3.9g醋酸铵到810mL水中，加入2.0mL三乙胺，3.0mL磷酸，10.0mL冰醋酸，混匀）-乙腈（824：146）乙腈，混匀。 |
十二烷基硫酸钠溶液（1.3gSDS至1L 0.1%磷酸溶液中）-乙腈（60:40）。 可根据系统适用性结果调整。 |
缓冲液：2L水中加入1.15ml磷酸，加入2.6g SDS，超声。 流动相A：甲醇-缓冲液（30:70） 流动相B：乙腈-缓冲液（75:25） |
磷酸盐缓冲液（取1mol/l磷酸溶液7.0ml与1mol/l磷酸二氢钠溶液50.0ml混合，用水稀释至1000ml，pH值应为3.0）-乙腈（8:2）（含0.101%庚烷磺酸钠） |
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洗脱方式 |
等度 |
等度 |
等度 |
梯度洗脱： |
等度 |
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其他检查条件 |
波长：280nm；柱温N/A；流速1mL/min；进样量：20micro;L。 |
波长：280nm；柱温30℃；流速：2mL/min。进样量：20micro;L。 |
波长：223nm；柱温30℃；流速0.9ml/min；进样量：10micro;L。 |
波长：223nm；柱温30℃；流速1ml/min；进样量：10micro;L。 |
波长：280nm；柱温N/A；流速N/A；进样量：40micro;L。 |
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稀释剂 |
流动相 |
流动相 |
流动相 |
乙腈-缓冲液（40:60） |
流动相 |
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系统适用性溶液 |
1.5mg美托洛尔杂质A 2.5mg供试品→50ml。 |
酒石酸美托洛尔对照品，加流动相溶解并稀释制成每lm l中含2mg的溶液，置石英杯中，在距离紫外光灯（254nm）下5cm处，放置3 小时，作为系统适用性溶液。 |
5micro;g/mL的琥珀酸盐美托洛尔、杂质A、B、C和D的混合溶液。 |
系统适用性溶液：3micro;g/ml杂质A和1mg/ml琥珀酸美托洛尔混合溶液； 灵敏度溶液：0.5micro;g/ml琥珀酸美托洛尔对照品 |
取H93/12对照品、H128/80对照品与琥珀酸美托洛尔对照品各适量，加流动相溶解稀释制成每1ml中分别含H93/12、H128/80与琥珀酸美托洛尔对照品1.5micro;g、0.2micro;g和1mg的溶液。 |
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对照溶液 |
自身对照溶液：供试品稀释1000倍。 |
10micro;g/ml自身对照（稀释200倍） |
1.0 micro;g/mL琥珀酸盐美托洛尔对照品溶液 |
对照品溶液：3micro;g/ml琥珀酸美托洛尔对照品溶液； |
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供试品 溶液 |
2mg/mL，以流动相溶解稀释。 |
2mg/mL，以流动相溶解稀释。 |
50mg→50ml，以流动相溶解稀释。 |
取粉末适量（相当于50mg琥珀酸美托洛尔）置50ml量瓶，加稀释液至量瓶体积的60%，超声并振摇30min，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，经0.45micro;m滤膜过滤。（1mg/ml） |
供试品溶液：取本品5片，置100ml量瓶（47.5mg规格）中，加水5ml，振摇使崩解，加乙醇30ml，振摇30分钟，再加与乙醇等体积的0.1mol/l盐酸溶液，继续振摇30min，加0.1mol/l盐酸稀释至刻度，摇匀，离心，精密量取上清液10ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。（1mg/ml） |
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系统适用性要求 |
杂质A和美托洛尔分离度应大于6.0。 相对保留时间RRT，主峰出峰时间7min，RRT（杂质C）=0.4，RRT（杂质A）=0.8。 |
相对保留时间RRT，主峰出峰时间7min，RRT（杂质I）=0.3，美托洛尔与杂质I分离度＞10.0，理论板数按美托洛尔峰即不低于3000。 杂质I对应EP标准中杂质C |
（1）分离度：有关物质A和B不少于2.5，B和C不少于1.5。 （2）相对保留时间RRT，RRT（杂质C）=0.6，RRT（杂质B）=0.7，RRT（杂质A）=0.8，RRT（杂质D，非对映异构体）=5.0和5.2。 （3）对照品重复进样RSDle;5.0% |
杂质A与美托洛尔分离度大于2.0. 对照品溶液：3micro;g/ml琥珀酸美托洛尔对照品溶液，要求RSD＜5.0%； 灵敏度溶液：0.5micro;g/ml琥珀酸美托洛尔对照品，要求s/n大于10； |
H93/12与美托洛尔峰的分离度应不小于2.5。 |
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限度 |
校正因子：在计算杂质C含量时，将杂质C峰面积乘以0.1。 杂质C：le;0.15%，非特定杂质：le;0.10% 总杂：le;0.5%，小于对照溶液主峰面积的0.5倍（及0.05%）的峰面积忽略不计。 |
杂质I校正因子=0.1。杂质I：le;0.3%；非特定杂质：le;0.3%；总杂：le;0.5% 小于对照溶液主峰面积的0.1倍（即0.05%）的峰面积忽略不计 |
单个单杂：le;0.1% 总杂：le;0.5% |
琥珀酸仅识别定性。 |
如显杂质峰，按外标计算；其他未知杂质以琥珀酸美托洛尔为对照品，单个杂质不得过0.2%，杂质总量不得过0.5%。 |
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备注 |
（1）3倍美托洛尔保留时间。 （2）酒石酸美托洛尔有关物质色谱条件相同，其中杂质相对保留时间：主峰出峰时间7min，RRT（杂质C）=0.6，RRT（杂质B）=0.7，RRT（杂质C）=0.4，RRT（杂质A）=0.8，RRT（杂质J）=1.4，RRT（杂质D）=1.6，RRT（杂质E）=1.8，RRT（杂质B）=2。 （3）色谱柱：C18柱，3.9mm*0.15m*5micro;m，孔径10mm，载碳量19%。 |
3倍美托洛尔保留时间 |
杂质含量（%）=100C（Cs/Cr）（ri/rs）. Cs为琥珀酸美托洛尔USP对照品浓度，CT为供试品中琥珀酸美托洛尔浓度，ri为各峰响应值，rs对照溶液的峰响应值。 杂质D计算的为双峰峰面积的结果。 |
杂质含量（%）=100times;（Cs/Cu）times;（ru/rs）. Cs为对照品溶液中琥珀酸美托洛尔浓度，Cu为供试品中琥珀酸美托洛尔浓度，ru为供试品中非特定降解杂质峰响应，rs对照溶液的峰响应值。 杂质D计算的为双峰峰面积的结果。 |
运行时间30min。 H93/12杂质、H128/80杂质分别对应BP标准中杂质B和杂质C。 |
仅EP/BP和USP中收载了原料药的有关物质方法，USP和进口注册标准中有收载缓释片剂，无缓释胶囊的相关药典收载。故分析方法开发拟参照原料药和缓释片剂的检测项方法开展。
由于杂质M和N紫外吸收弱，杂质O的极性强，保留强，因此BP/EP和USP药典中，均采用薄层色谱的方法，且方法一致。故杂质M、N和O拟采用薄层色谱法，上述杂质为原料药合成过程产生的，故只在原料药中进行控制。
- 研究目的及意义
- 目的
用液相色谱法开发和建立琥珀酸美托洛尔缓释胶囊中有关物质2（除杂质M、N和O）检测方法，应用于琥珀酸美托洛尔缓释胶囊。
- 意义
为琥珀酸美托洛尔缓释胶囊有关物质检测提供参考。
- 研究内容
实验流程
方法对比与优化→专属性确认→检测限/定量限→线性范围考察→准确度检测→色谱柱耐用性考察→溶液稳定性→确立有关物质检测方法
1.有关物质2检测方法对比与优化
1.1方法对比
对4种药典方法进行对比
（1）各参考文献中检测波长不一致（223nm或280nm），故在方法开发阶段选择DAD检测器，主要提取280nm和223nm波长下，此外结合杂质和主峰的响应及最大吸收波长，再确定检测波长。
（2）各国药典中系统适用性主要是考察美托洛尔与杂质C或者美托洛尔与杂质B的分离度，故方法对比中主要考察美托洛尔峰与杂质A或杂质B或杂质C的分离情况，并已美托洛尔与杂质A、B、C和杂质D的混合溶液作为系统适用性溶液，比较各国药典方法的优劣。
（3）检测浓度：各标准的供试品浓度和进样量不一样，拟参考进样质量（40micro;g）进行方法对比，后期根据杂质灵敏度，进行浓度调整。
1.2方法优化
对比参考文献，USP（API）和进口注册标准的流动相含离子对试剂，如SDS和庚烷磺酸钠，推测主峰和杂质保留较弱，通过添加离子对试剂增强保留；EP标准流动相中含三乙胺，可能主峰存在拖尾，加三乙胺改善拖尾。根据方法对比的结果，故在方法优化将进行流动相种类和浓度的筛选。
故有关物质方法优化，拟从梯度优化，有机相的种类（甲醇or乙腈）、比例，流动相pH值、缓冲盐和离子对试剂种类和浓度、流速、柱温、不同品牌色谱柱等方面开展。
2.专属性确认
2.1强制降解试验确认（采用DAD进行检测）
2.1.1内容
酸破坏、碱破坏、氧化破坏、光照破坏、高温破坏
2.1.2破坏强度筛选标准
使主峰降解率在5%-10%范围内。
2.1.3各强制破坏试验可接受标准
①各降解条件下，主峰与邻近峰的分离度均ge;1.5；
②主峰纯度：各降解条件主峰纯度不大于纯度阈值（Waters液相），或者最小峰纯度指数大于0（岛津液相）；
③物料平衡应在90%~110%之间。
2.2空白试验及已知杂质的分离情况确认（采用DAD检测器）
2.2.1内容
对空白溶剂、空白辅料、已知杂质(单杂)、API、API 混合杂质、供试品进行测定，以确认主峰与杂质、杂质与杂质间分离度符合要求，且空白溶剂及空白辅料均不构成干扰。
2.2.2可接受标准
①辅料及空白溶剂在主峰及杂质出峰位置应无干扰峰出现；
②已知杂质与主峰及杂质与杂质峰之间分离度应不小于1.5。
2.灵敏度：检测限/定量限
分别取API和各杂质对照品适量，用稀释溶剂依次逐级稀释进样。S/Nge;3：检测限；S/Nge;10：定量限各杂质定量限溶液浓度应不大于供试品浓度的0.05%。
3.线性范围考察
4.准确度检测
5.色谱柱耐用性考察
先考虑琥珀酸美托洛尔缓释片进口注册标准（JX20170108）和缓释胶囊专利[10]（US9700530B2）中推荐的C8柱（Lichrospher 60 RP-Select B，125mmtimes;4.0mm，5micro;m）进行方法对比。另BP2019和ChP2015标准中收载的有关物质检测采用C18柱，故同时选用C18柱测定API 混杂样品，并与C8柱比较分离度和杂质谱，结合方法重现性，初步确定规定色谱柱品牌，填料及规格等。
表3.5-1拟筛选色谱柱信息
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序号 |
品牌 |
填料 |
型号/规格 |
备注 |
|
1 |
默克 |
C8 |
Lichrospher 60 RP-Select B，125mmtimes;4.0mm，5micro;m |
进口注册标准 |
|
2 |
月旭 |
C18 |
3.9times;150mm，5mu;m |
BP2019和ChP2015 |
根据杂质分离情况，初步确定色谱柱填料后，再考察相同填料不同型号或不同厂家的色谱柱，根据杂质分离情况，确定色谱柱型号。
6.溶液稳定性
6.1内容
供试品溶液和自身对照溶液在室温下放置0、8、16、24、48小时，分别进样，HPLC检测。
6.2判定标准
在考察的时间内，与0h比较，（1）自身对照溶液主峰变化率在plusmn;2.0%（公式：（An-A0）/A0*100%）；（2）杂质变化率即为杂质绝对差值变化：①当X＜0.05%，测量值不做比较；②当0.05%le;X＜0.10%，时间点测量值与0h的差值在0.05%内；③当Xge;0.10%，时间点测量值与0h的差值在0.10%内。③当0.5%＜Xle;1.0%，时间点测量值与0h的差值应在0.2%以内；④当X＞1.0%，时间点测量值与0h的差值应在0.3%以内。未产生大于0.05%的其他未知杂质。说明供试品在该稀释剂中稳定
7.确立有关物质检测方法
- 预期困难及拟解决办法
1)杂质F、杂质J和美托洛尔在各色谱条件下，不能兼顾三者的分离。
拟解决办法：厂家有关物质方法是遵循USP42原料药的方法，没有进行大体系改变，可在此条件的基础上进行有机比例的调整，看是否能改变三者之间的分离状态。
- 极性弱的杂质洗脱很早，基本在死时间内保留。
拟解决办法：适当降低初始条件的有机相比例，增加弱极性杂质的保留。
五、可行性分析
1.理论基础
课题成员已开展了充分调研，各国药典中关于美托洛尔的标准和进口注册标准中对琥珀酸美托洛尔缓释胶囊有关物质检测方法均有重要参考意义，通过设计实验比较各方法，再进一步优化，可建立可行的检测方法；
2.设备基础
实验室仪器试剂耗材等配备齐全，完全能满足本课题的设备条件；
3.技术基础
参与本课题的成员均通过查阅大量文献积累了较多课题相关知识，并已熟练掌握实验中所涉及的基本操作和仪器操作。
六、预期成果
①建立检测琥珀酸美托洛尔缓释胶囊有关物质的有效方法；
②能为其他琥珀酸美托洛尔制剂有关物质检测提供参考；
③做出一篇高质量毕业论文。
参考文献
[1]琥珀酸美托洛尔BP2019药典标准
[2]琥珀酸美托洛尔EP9.0药典标准
[3]酒石酸美托洛尔ChP2015药典标准
[4]琥珀酸美托洛尔USP42药典标准
[5]琥珀酸美托洛尔缓释片USP42药典标准
[5]琥珀酸美托洛尔缓释片进口注册标准（标准号JX20170108）
[7]琥珀酸美托洛尔合成路线（浙江普洛家园药业有限公司）
[8]陈岩蓓, 蒋文玉. RP-HPLC测定琥珀酸美托洛尔缓释片的含量及有关物质[J]. 安徽医药, 2015, 19(12):2306-2309.
[9]强制降解试验技术指南
[10]琥珀酸美托洛尔缓释胶囊专利（专利号：US9700530B2）
[11]XunQ . Advancing USP compendial methods for fixed dose combinations: A case study of metoprolol tartrate and hydrochlorothiazide tablets[J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 9(02):11-16.
开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
琥珀酸美托洛尔缓释胶囊的有关物质方法开发
- 研究背景
1.药品信息
美托洛尔是全球首个beta;1的选择性（心脏选择性）肾上腺素能受体阻断剂，临床用于高血压、心绞痛、心律失常等及伴有左心室收缩功能异常的症状稳定的慢性心力衰竭。于1969年在瑞典的Hassle实验室研发成功。国内广泛应用琥珀酸美托洛尔缓释片倍他洛尔。琥珀酸美托洛尔缓释胶囊是根据缓释片改剂型开发的品种。胶囊剂与片剂相比，其在胃肠道中崩解较片剂快，吸收更好且对肠胃的刺激较小。这意味着琥珀酸美托洛尔缓释胶囊有着良好的市场前景。
本品主要成份为琥珀酸美托洛尔。化学名称：1-异丙氨基-3-[对-(2-甲氧乙基)苯氧基]-2-丙醇L( )-琥珀酸盐。
- 药品中有关物质检测的意义
有关物质，其正确的定义是:有关物质主要是在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中的降解产物等。
有关物质研究是药品质量研究中关键性的项目之一，其含量是反映药品纯度的直接指标。对药品的纯度要求，应基于安全性和生产实际情况两方面的考虑，允许含限定量无害的或低毒的共存物，但对有毒杂质则应严格控制。毒性杂质的确认主要依据安全性试验资料或文献资料。与已知毒性杂质结构相似的杂质，亦被认为是毒性杂质。
各国药典均未收载琥珀酸美托洛尔缓释胶囊的质量标准，未见琥珀酸美托洛尔缓释胶囊有关物质检测方法。
- 杂质列表
EP9.0和BP2019中提到的琥珀酸美托洛尔原料药有12个杂质，下面以BP2019药典标准中杂质情况为例进行列表说明：
