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课题名称 |
肿瘤新生抗原的预测与筛选 |
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毕业设计的内容和意义 |
内容： 1.找出肿瘤组织中的特异性突变多肽，获得HLA分型。 2.MHC-肽结合预测软件预测 MHC 呈递的多肽。 3.进一步筛选可信度高的新抗原，降低阳性肽条目。 意义： 新生抗原与MHC形成的肽-MHC复合物可以激活CD4和CD8 T细胞对肿瘤细胞的响应并最终导致肿瘤的消退，是肿瘤免疫疗法未来的发展方向之一。对新生抗原的预测与筛选有助于开发相应的疫苗，推动免疫疗法进一步发展。 |
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文献综述 |
新生抗原预测的意义与方法 新生抗原，即新形成的，过去未被免疫系统识别的抗原，通常是肿瘤细胞遗传变异（如单核苷酸改变和移码突变）产生的多肽或病毒相关肿瘤产生病毒蛋白[1]。有时，新生抗原也被定义为任何具有完全肿瘤特异性的肽，包括磷酸肽和异常的RNA剪接(RNA-Splicing)产生的多肽，但考虑到这些多肽也可能在健康组织中低水平表达，因此更多采用前一种定义[2]，在本综述中也仅讨论前一种情况。 肿瘤细胞中基因突变的累积会导致其蛋白质组发生相应的变化，形成全新的氨基酸序列，而且遗传物质和表观遗传学的改变，会使肿瘤细胞表达一系列正常细胞中不存在或水平较低的蛋白质，这些蛋白质可以被降解为肽段并成为抗原决定簇（新表位）[3]。而T细胞可以识别主要组织相容性复合物(MHC)在肿瘤微环境中呈现的抗原决定簇，激活CD4和CD8 T细胞对新生抗原的响应，并最终导致肿瘤的消退[4]。 遗传变异可以按程度的大小分为三类单核苷酸改变(Single-Nucleotide Variants, SNV)，导致移码突变的插入和缺失(Indel)及结构改变 (SV)。理论上，任何因遗传物质改变而产生的多肽都可以被认为是潜在的新生抗原，也就是说，肿瘤突变负荷(Tumor Mutational Burden, TMB)应该与免疫疗法的临床反应性呈正相关。但实际上在导致肿瘤产生新氨基酸序列的突变中只有一小部分能成为会被T细胞识别的新生抗原，而有些患者的虽然肿瘤突变负荷(TMB)很低，但却能产生强大的抗原[2]，因此开发出能更准确地预测肿瘤细胞上的新生抗原的技术是十分必要的。 理想状态下，解决新生抗原问题最好的方法是直接检测患者肿瘤细胞上MHC呈递的新生抗原的数量及针对这些抗原的T细胞应答数量，但这种技术实际上尚未完全开发，因此研究者只能选择另辟蹊径。早在20年前，Coulie[5]和Wolfel[6]等就利用肿瘤细胞系的cDNA文库筛选可被肿瘤特异性T细胞识别的RNA转录本并从原理上证明了利用新生抗原进行免疫治疗的可行性，但其技术的复杂性使这种方法未得到广泛的应用。近几年高通量外显子组测序技术的发明及T细胞反应性测定相关技术的进步使肿瘤新生抗原领域重新焕发生机[7]。 目前，对新生抗原的预测主要通过以下几个步骤进行： 1.从患者体内提取健康细胞与肿瘤细胞的样本。 2.对两份样本分别进行全外显子测序找出肿瘤细胞中的突变位点。 3.结合RNA测序数据分析肿瘤细胞因基因突变产生的全新氨基酸序列，找出可能的新生抗原。 4.在计算机中通过一定算法模拟氨基酸序列与患者自身MHC的结合过程，筛选出可以被MHC分子呈递及被T细胞受体(T-cell Receptor, TCR)库识别的潜在新生抗原。 5.通过实验验证潜在新生抗原是否可以引起T细胞反应性变化。 针对潜在新生抗原的筛选，目前研究人员已经开发出了多种算法，如netMHCpan[8]，EBCall[9]等，可以模拟多肽与MHC结合及被TCR库识别的不同步骤，因此可以将多种算法结合起来寻找最可能的新生抗原。 多肽能否与MHC结合是由许多参数共同决定的。首先是作为潜在新生抗原的多肽的数量与其相对应的蛋白质的每单位时间降解量成比例，实验证据[10]也表明，MHC结合肽库中蛋白质的表达与RNA表达水平有关，因此，可以通过肿瘤细胞中RNA的丰度数据对潜在新生抗原进行初步筛选。蛋白质的降解后被转运到内质网(ER)内腔，与ER中驻留的MHC-Ⅰ 类分子结合并最终呈现在细胞表面，在这一系列步骤中MHC-Ⅰ 分子的配体偏好对MHC呈递的肽库影响最大[11]，因此可以使用如netMHCpan的神经网络模型在合理的置信度下对抗原加工的这一过程进行模拟[8]。此外，也可以用模拟蛋白酶体加工的NetChop[12]或模拟肽转运的NETCTL[13]进行辅助模拟。除了上述的这些模型，尚有可以预测多肽与MHC相互作用稳定性等其他参数的多种模型，因此目前需要解决的关键问题在于如何合理得综合一系列参数及模型，得到最可信的模拟结果。 遗憾的是，目前开发出的预测算法基本只对SNV产生的新生抗原效果较好，对于插入缺失(Indel)和结构改变(SV)产生的新生抗原预测的出现假阴性的概率仍居高不下[14]。而MHC-Ⅱ分子因具有复杂性，如CD4 T细胞可能通过识别肿瘤细胞加工产生的内源性抗原或从抗原呈递细胞处获得抗原而产生肽-MHC复合物，所以现有模型对MHC-Ⅱ限制性表位的预测效果也不是很理想[4]，这也是未来新生抗原领域研究的重要方向。 新生抗原预测的另一个问题在于现有的预测模型不能保证T细胞对新生抗原的反应性。研究指出，目前仅有约50%的MHC呈递病毒表位观察到T细胞反应性[2]，原因被认为是难以生成反应性TCR或反应性TCR也对自身抗原有反应，因此从TCR库中删除[11]。考虑到目前的新生抗原预测主要针对的是与自身多肽仅有一个氨基酸之差的SNV型新生抗原，T细胞不产生反应性的原因是后者的可能性相当高，而基于这一假设的新预测模型也在开发中。 总之，从目前的临床数据来看，为基于新生抗原的免疫疗法在肿瘤的靶向治疗中具有良好的前景，但目前仍然没有足够精确的模型能够准确预测新生抗原，因此该领域依然会是未来肿瘤免疫疗法研究的重点。 参考文献： [1] Yuan J, Hegde P S, Clynes R, et al. Novel technologies and emerging biomarkers for personalized cancer immunotherapy[J]. J Immunother Cancer, 2016, 4: 3. [2] Schumacher T N, Scheper W, Kvistborg P. Cancer Neoantigens[J]. Annual Review of Immunology, 2019, 37(1): 173-200. [3] Heemskerk B, Kvistborg P, Schumacher T N. The cancer antigenome[J]. EMBO J, 2013, 32(2): 194-203. [4] Kreiter S, Vormehr M, Van De Roemer N, et al. Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immune responses to cancer[J]. Nature, 2015, 520(7549): 692-6. [5] Coulie P G, Lehmann F, Lethe B, et al. A mutated intron sequence codes for an antigenic peptide recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92(17): 7976-80. [6] Wolfel T, Hauer M, Schneider J, et al. A p16INK4a-insensitive CDK4 mutant targeted by cytolytic T lymphocytes in a human melanoma[J]. Science, 1995, 269(5228): 1281-4. [7] Matsushita H, Vesely M D, Koboldt D C, et al. Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting[J]. Nature, 2012, 482(7385): 400-4. [8] Jurtz V, Paul S, Andreatta M, et al. NetMHCpan-4.0: Improved Peptide-MHC Class I Interaction Predictions Integrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data[J]. J Immunol, 2017, 199(9): 3360-3368. [9] Shiraishi Y, Sato Y, Chiba K, et al. An empirical Bayesian framework for somatic mutation detection from cancer genome sequencing data[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(7): e89. [10] Granados D P, Yahyaoui W, Laumont C M, et al. MHC I-associated peptides preferentially derive from transcripts bearing miRNA response elements[J]. Blood, 2012, 119(26): e181-91. [11] Yewdell J W. Confronting complexity: real-world immunodominance in antiviral CD8 T cell responses[J]. Immunity, 2006, 25(4): 533-43. [12] Nielsen M, Lundegaard C, Lund O, et al. The role of the proteasome in generating cytotoxic T-cell epitopes: insights obtained from improved predictions of proteasomal cleavage[J]. Immunogenetics, 2005, 57(1-2): 33-41. [13] Larsen M V, Lundegaard C, Lamberth K, et al. An integrative approach to CTL epitope prediction: a combined algorithm integrating MHC class I binding, TAP transport efficiency, and proteasomal cleavage predictions[J]. Eur J Immunol, 2005, 35(8): 2295-303. [14] Xu C. A review of somatic single nucleotide variant calling algorithms for next-generation sequencing data[J]. Comput Struct Biotechnol J, 2018, 16: 15-24. |
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研究内容 |
1.根据健康细胞和肿瘤细胞的全外显子测序数据找到肿瘤细胞中发生单氨基酸改变的蛋白质。 2.结合肿瘤细胞的RNA丰度预测潜在的新生抗原。 3.综合应用netMHCpan，EBCall等模型筛选可信度高的新生抗原并进行实验验证。 |
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研究计划 |
2020.3-2020.4：查找并阅读相关文献，明确课题内容，按照课题需要安装系统和软件以便后续工作； 2020.4-2020.5：进行肿瘤新生抗原的预测和筛选工作； 2020.5-2020.6：整理并汇总实验数据，得到实验结果，完成论文以及准备答辩资料。 |
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特色与创新 |
近年来，随着全外显子测序技术的发明，针对肿瘤新生抗原的预测模型逐渐增多，但现有的模型都只针对新生抗原产生过程中的某一个过程进行预测，可信度有限。本课题将尝试使用多种模型，综合筛选出肿瘤中的新生抗原，并进行实验验证。 |
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