rhIL23R-CHR/Fc抑制CIA小鼠体内TH17细胞分化的流式细胞检测文献综述

开题报告内容：

一、课题的研究背景、意义和目的

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎症为特征的慢性自身免疫性疾病。炎症反复发作可导致关节内软骨和骨的破坏，并伴有关节功能障碍。目前的研究表明，T细胞异常免疫应答在RA发生发展中发挥了很大的作用。小鼠胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)是当前研究RA较理想和最为常用的动物模型，它在临床症状和病理表现方面与RA极为相似或相同。

Th17代表一类不同于Th1或Th2的CD4 Th细胞亚群，主要分泌IL-17A/F，IL-6，TNF等细胞因子,具有很强的促炎症作用，并与多种自身免疫病的发生和发展有关。目前动物实验中Th17/IL-17在RA中的作用表现为，局部过多的IL-17明显加重了CIA。

IL-23不是Th17分化的必需因子但它是Th17的重要存活因子，小鼠缺乏IL-23几乎没有Th17细胞，IL-23缺乏不影响Th17细胞的正常产生，却使其不能正常扩展和存活。

本文在建立CIA模型基础上，采用流式细胞术(FCM)分别检测对照组与rhIL23R-CHR/FC干预组的CIA小鼠体内Th17细胞的比例，来研究rhIL23R-CHR/Fc对RA是否有治疗作用，并为类风湿性关节炎靶向性药物研发提供理论与实验数据。

1. 课题研究的主要内容

在前期的研究中，我们获得了rhIL23R-CHR/Fc分子。在此基础上，本课题拟进一步开展如下研究：

1. 建立类风湿性关节炎（RA）胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型

每组6只，四组，共24只雌性6-8周龄(130-150g)Wistar大鼠，随机分为模型组、蛋白干预组和阳性药组。抗原制备：模型组大鼠尾根部皮内注射鸡Ⅱ型胶原肽和弗氏完全佐剂混合乳剂，胶原终浓度为2mg/ml，初次免疫注射胶原200mu;L，7天后同样剂量加强免疫一次，此次注射鸡Ⅱ型胶原肽和弗氏不完全佐剂混合乳剂，诱导Wistar大鼠产生关节炎。蛋白干预组在免疫同时用rhIL23R-CHR/Fc融合蛋白进行干预，尾静脉注射，每只大鼠每次注射200mu;grhIL23R-CHR/Fc融合蛋白，隔天给药直至第20天。

1. CIA模型鼠注射rhIL23R-CHR/Fc分子后，观测其对体内Th17分化水平影响

实验结束时无菌提取四组大鼠脾脏，分离CD4 淋巴细胞培养。加入终浓度为10ng/mL的PMA以及终浓度为1mu;M的ionomycin，同时1:1500的比例加入Golgistop作用4-6h。1000rpm离心5min收集细胞，首先加入anti CD16/32，避光冰上放置30分钟，加入anti-PE-CD4细胞表面染色，室温避光孵育30分钟，离心洗涤，固定破膜，加入anti-APC-IL-17抗体胞内染色，室温避光孵育30分钟，1000rpm离心5min洗涤细胞，PBS重悬后检测Th17细胞（CD4 IL17 ）比例。

三、研究难点

动物模型建立的不稳定性：建立稳定的动物模型是本课题的重点也是难点。

动物模型的建立受许多外界因素的影响，因此需严格控制不同实验组的一致性水平。实验前确保蛋白药物活性，尾静脉注射药物，并且依据大鼠不同体重，给予不同给药量。

四、进度安排

2015.3－2015.4 文献调研，撰写开题报告2015.4－2015.5 CIA造模，给药，流式细胞检测Th17细胞分化水平

2015.5－2015.6 整理数据，撰写论文

五、综述

Th17细胞与类风湿性关节炎

摘要: 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性自身免疫性疾病。目前常用的治疗自身免疫疾病发病的药物均容易出现严重感染等并发症，且停药后容易复发。因此，寻找一种新的特异的针对炎症连锁反应关键步骤的治疗措施十分必要。自从Th17途径被认为是与自身免疫性疾病密切相关后，抑制Th17通路也成为治疗自身免疫性疾病的主要靶点。给予IL-17单克隆抗体治疗^[1,2]能够改善RA病情的进展。本文主要介绍TH17细胞与类风湿性关节炎的关系、IL23与Th17细胞关系以及以Th17为靶点的类风湿性关节炎靶向性治疗药物研究概况。

关键词: IL-23 Th17细胞 类风湿性关节炎（RA）

目前常用的治疗自身免疫疾病发病的药物（如5-ASA、糖皮质类固醇激素和各种免疫抑制剂对免疫系统）均表现出强大而广泛的抑制作用，但均容易出现严重感染等并发症，且停药后容易复发。因此，寻找一种新的特异的针对炎症连锁反应关键步骤的治疗措施十分必要。Th17细胞作为一群新发现的CD4 效应T细胞，其生物学特性、分化及功能愈来愈被重视，它在自身免疫性疾病中的作用为这类疾病治疗提供了新的思路。

1. TH17细胞与类风湿性关节炎

类风湿性关节炎（RA）是一种免疫介导的关节疾病，伴随慢性炎症和滑膜增生，最终导致软骨和骨破坏。大量实验数据显示，CD4 T细胞尤其是Th17细胞在RA系统性免疫应答发生的起始中发挥重要作用。Th17细胞以分泌IL-17为特征，但也分泌其他的炎症因子，这些因子在炎症过程中发挥了相当重要的作用。Th17细胞特异性表达IL-17A和IL-17F，两者关系密切，都是同型二聚体细胞因子，并具有相同的受体^[3]。近期有研究显示RA间充质细胞可促进Th17细胞向炎性部位迁移，发生增殖并分泌IL-17，从而促进Th17细胞介导的慢性炎症，该研究证实了免疫细胞和间充质细胞间相互作用对RA发病的重要性。此外，骨免疫学研究显示Th17相关细胞因子如IL-17可刺激滑膜成纤维细胞，使其产生RANKL，RANKL是破骨细胞分化因子，可促进破骨细胞前体向破骨细胞转变，最终导致骨破坏^[4]。Th17细胞通过产生自身抗体、激活初始免疫细胞和滑膜成纤维细胞，最后破坏骨，参与关节炎发生的三个阶段。

二、IL23与Th17细胞

IL-12和IL-23的结构相似，他们都含有一个p40亚基，该亚基是这两种细胞因子发挥生物功能和受体功能必不可少的。IL-12中p40共价链接到p35亚基，而IL-23中p40与一个独特的p19亚基相连。在体内每个亚基通过激活树突状细胞(DC)而表达,但在激活抗原呈现细胞(APC)中对p35和和p19表达的严格控制是IL-12和IL-23表达所必须的^[5]。IL-23是在TLR效应之后又由DCs和巨噬细胞产生的，并在CD40激活后通过相互作用会继续扩增。IL-23R被细胞因子IL-6和IL-23调控[6]。研究发现IL-23在APCs的表达促进了T细胞的扩增^[7]。 IL-23对于Th17维持存活和扩增发挥重要作用，研究发现缺乏IL-23的小鼠体内几乎没有Th17细胞的存在^[8],这提示了在缺乏IL-23时即使Th17细胞能正常产生，但如果没有IL-23这种细胞因子的支持，Th17细胞是不能正常扩增和生存的。体内研究数据显示，无论是Th17细胞针对细菌感染的抗感染免疫反应还是Th17介导的自身免疫疾病的慢性炎症维持^[9]，都需要IL-23的参与。IL-23在Th17细胞分化过程中具体的作用机制被认为与STAT-3有关，因为IL-23可以介导STAT-3的磷酸化过程，是STAT-3激活从而促进IL-17的分泌^[10]。

三、CIA与RA

RA动物模型包括大鼠佐剂诱导关节炎（rAIA），胶原诱导性关节炎（CIA），胶原蛋白抗体诱导性关节炎（CAIA）等。胶原诱导性关节炎（CIA）通过尾根部皮内注射Ⅱ型胶原肽与弗氏完全佐剂混合乳剂获得[11]，CIA模型鼠表现出滑膜增生、单核细胞浸润、软骨降解等症状，与RA类似。由于其重复性好，易于界定，是常用RA动物模型。

四、以Th17为靶点的类风湿性关节炎靶向性治疗药物研究概况

自从Th17途径被认为是与自身免疫性疾病密切相关后，抑制Th17通路也成为治疗自身免疫性疾病的主要靶点。针对IL-17为靶点的中药治疗RA的研究也越来越多，刘丹丹[12]等研究发现表明没食子儿茶素没食子酸酯是强抗氧化、抗炎、抗肿瘤复合物，能减少IFN-gamma;、IL -17 ，IL -6 ，IL-1beta; 和TNF-alpha;的产生，同时减少Thl 和T hl7 的数量，增加 Treg 细胞的数量，抑制 CIA 大鼠的慢性炎症，达到一定的治疗作用。 赵海梅[13]等研究发现全蝎、蜈蚣可有效缓解胶原免疫性关节炎大鼠的关节损伤，其作用机制可能与参与 Th17/Treg 分化的细胞因子 IL -2 、IL-4 、IL-1O 的表达水平升高相关。

给予IL-17单克隆抗体治疗^[1,2]能够改善RA病情的进展。在对所有参与人Th17细胞发育所需要细胞因子的研究中，IL-23始终作为关键的细胞因子受到关注。抗IL-23p19抗体已被证明能有效治疗RA^[14]。新药ustekinumab（CNTO-1275）为人源化抗IL-12/IL-23p40单克隆抗体，2008年12月在加拿大首次上市，适应症为银屑病治疗。Ustekinumab主要通过与IL-12/IL-23p40亚基特异性结合阻止Th1及TH17通路，达到治疗的目的，而且研究表明该抗体也可降低克罗恩氏病的破坏作用，这些研究成果已发表在2012年10月份的新英格兰医学杂志上^[15]，说明从上游阻断Th17细胞的分化扩增及其相关细胞因子，可以起到预防或者阻止自身免疫性疾病发生发展的作用。以IL-17为靶点治疗自身免疫性疾病的研究已成为热点，已进入到一期临床试验的IL-17单克隆抗体治疗RA患者的病情有明显改善，且治疗效果明显好于使用安慰剂的患者^[16,17]。

由于很多细胞介导的自身免疫性疾病是由Th17而不是Th1细胞发挥主要作用，我们计划只阻断Th17免疫应答途径，干预IL-23介导的特异性信号级联通路。rhIL23R-CHR/Fc分子在自身免疫性疾病EAE模型鼠上已表现出了明显的治疗作用，有潜在的药用价值。本实验拟在建立CIA模型基础上，采用流式细胞术(FCM)分别检测对照组与rhIL23R-CHR/FC处理组的CIA小鼠体内Th17细胞的比例，来研究rhIL23R-CHR/Fc对RA是否有治疗作用，并为类风湿性关节炎靶向性药物研发提供理论与实验数据。

五、参考文献

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