开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一．拟研究的问题
多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域非常重要的研究方法之一，可分为Merrifield和Fmoc方法，在生物药物、蛋白质工程、免疫学等研究中得到了广泛的应用。Fmoc法以Fmoc作为氨基保护基，Fmoc对酸稳定，易与碱相互作用，可用碱性化合物脱保护。
HM-3是十八个氨基酸的血管生成抑制多肽，其分子中含RGD序列具有整合素亲和性，前期研究表明其作用靶点为整合素(alpha;vbeta;3)，该抑制剂在体外实验中能显著抑制内皮细胞迁移，经体内活性筛选发现该多肽具有抑制肿瘤血管生成和显著的抗肿瘤作用，且无耐药性无明显毒副作用，该多肽在医疗行业有广阔的应用前景。但其工业合成方法不太理想，不便于大规模生产。
本课题需要对抗肿瘤多肽HM-3的合成工艺进行研究，提高合成多肽HM-3的成功率。
二．实验目的
本实验主要研究抗肿瘤多肽HM-3的固相合成工艺，提高多肽合成产量、优化合成路线，为工业化合成目的肽提供理论依据。
三．材料和仪器
1.材料和试剂
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Fmoc-Asp(OtBut)-Wangresin、Fmoc-Gly-OH Fomc-Arg-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-val-OH Fomc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp-OH HOBT、TBTU |
吉尔生化（上海）有限公司 |
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DIEA（二异丙基乙胺） |
上海彭滕精细化工有限公司 |
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哌啶 |
国药集团化学试剂有限公司 |
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吡啶、苯酚、水合茚三酮（苯骈戊三酮）、DCM（二氯甲烷）、DMF（N,N-二甲基甲酰胺）、TFA（三氟乙酸）、乙醚、EDT（1,2-乙二硫醇） |
南京化学试剂有限公司 |
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苯甲硫醚 |
南京晚晴化玻仪器有限公司 |
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甲醇 |
江苏汉邦科技有限公司 |
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乙腈 |
ROESCIENTIFIC.INC |
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娃哈哈纯净水 |
杭州娃哈哈百立食品有限公司 |
2.实验仪器
（1）设备
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UPH-Ⅱ-5T超纯水机 |
成都超纯科技有限公司 |
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SHB-3循环水式多用真空泵 |
郑州杜甫仪器厂 |
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BT25S电子天平 |
赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 |
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YP6002电子天平 |
上海良平仪器仪表有限公司 |
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HH-S2数显恒温水浴锅 |
江苏金坛市金城国际实验仪器厂 |
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HZQ-X100恒温振荡培养箱 |
太仓市华美生化仪器厂 |
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TDZ5台式低速离心机 |
湖南赫西仪器装备有限公司 |
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LC6000型制备高效液相色谱仪 |
北京创新通恒科技有限公司 |
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RE52-3旋转蒸发器 |
上海沪西分析仪四厂有限公司 |
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LC-5C岛津液相色谱仪（分析用） |
江苏省科学器材有限公司 |
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HJ-3磁力恒温搅拌器 |
常州杰博森仪器有限公司 |
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GR-150-1干式培养器 |
太仓市华利达实验设备有限公司 |
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FD-1A-50真空冷冻干燥机 |
北京博医康实验仪器有限公司 |
|
超声波清洗器 |
上海新苗医疗器械制造有限公司 |
（2）器材
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移液枪 |
大龙 |
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锥形瓶 |
上海同兴化工仪器有限公司 |
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层析柱（接肽反应用） |
上海同兴化工仪器有限公司 |
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试管、离心管等其他耗材 |
南京友乐博 |
四、实验方法
本实验为固相多肽合成法，合成工艺包括：
1.接肽：溶胀-洗涤-去保护-缩合-洗涤-去保护-洗涤-缩合......目的肽
2.切肽
3.后处理
4.纯化
五、文献综述
多肽固相合成
【摘要】探讨抗肿瘤多肽HM-3的固相合成工艺，并为工业化合成目的肽提供理论依据。多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域非常重要的研究方法之一，应用非常广泛。以Fmoc保护基保护的a-氨基酸和王树脂为原料，经过HOBT、TBTU、DIEA缩合，20%哌啶的DMF溶液进行脱保护，经切割液将HM-3粗品从王树脂上切割下来，高效液相色谱分析纯化,最终得到目的肽。
【关键词】多肽、固相合成、合成工艺路线、HM-3
1.概述
1932年，MaxBergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护alpha;-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才有了一定的发展。20世纪50年代，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法，这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法。利用这一方法几乎能高收率的制备任何多肽。1978年，Meienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc基团作为氨基保护基成功的进行了多肽合成。Fmoc固相法已得到了广泛的应用并愈加受到人们的重视。多肽固相合成在生物制药及蛋白质工程中有着广阔的应用前景。
2.多肽固相合成
2.1多肽固相合成的原理
首先对组成目的肽的氨基酸进行改造，使其成为氨基末端带有保护基的氨基酸。将目的肽的第一个氨基酸的羧基以共价键形式与固相载体相连，再以这一氨基酸的氨基为合成起点，使其与相邻氨基酸的羧基发生酰化反应，形成肽键。然后让包含有这两个氨基酸的树脂肽的氨基与下一个氨基酸的羧基反应，不断重复这一过程直至目的肽形成为止。接着，目的肽从树脂上裂解，进行氧化折叠，这样得到了目的肽的粗产品。再进行纯化、化学修饰、进行活性炭鉴定。Fmoc固相合成法是常用的多肽合成法，其反应条件温和，单步反应产率高达98%以上。
2.2多肽固相合成的分类
多肽固相合成在近几十年的发展中逐渐分化为两种类型。一：Merrifield固相合成，也称为Boc固相合成。二：Atherton和Shepard所发展的Fmoc固相合成法。由于脱Fmoc保护基以及将产物从树脂上切割下来反应条件温和，而且与Boc固相合成法相比Fmoc固相合成法副反应少，所以Fmoc固相合成法已被广泛采用。
2.3多肽固相合成的关键点
2.3.1载体的选择：关系到反应溶剂的选择，关系着切割后多肽末端带有何种基团，关系到溶剂的扩散速率，影响固相接肽反应的速度与合成量。本实验选择连有一个天冬氨酸的王树脂，王树脂在肽的固相合成中具有条件温和，副反应少，产率高等优点，因此被广泛应用于活性多肽合成。此外，王树脂还有机械强度好，便于振荡搅拌；在常用溶剂DCM和DMF中有良好的溶胀性，耐酸耐碱，内部并有很大的网格空间，利于肽的延长。
2.3.2氨基酸的保护策略：接肽反应中不参与酰胺键形成的活性基团需要保护，并且在反应结束后能顺利脱保护。一般情况下，肽链的a-羧基端固定在载体上进行保护，所以需寻找合适的a-氨基保护基，保护基的选择决定了产物的产率、纯度，脱帽试剂的选择与切割试剂的选择等等。常用的a-氨基保护基有Boc、Fmoc、苄氧羰基、对甲苯磺酰基、三苯甲基等。Boc法是经典法，有效减少副反应，缺点在于反复用酸脱保护会将肽链从载体上切除下来，改变一些氨基的侧链等。Fmoc法条件温和，副反应少，耐酸。常用20%哌啶/DMF容易经beta;-消除脱保护。产率高、操作简单，便于实现自动化。
2.3.3缩合剂的选择：缩合剂的选择影响肽键的生成及副反应的发生。Fmoc合成法常用的缩合剂为HOBT/TBTU/DIEA,这种缩合剂体系明显缩短了反应时间，减少了副反应的发生，也有利于抑制消旋反应出现。
2.4多肽固相合成的基本步骤
2.4.1树脂的活化
2.4.2氨基酸的偶联
2.4.3多肽的切除与沉淀
2.4.4多肽的分离纯化
【参考文献】
（1）宋晓骥王立策多相固态合成，科技论坛
（2）符友伟，吴蕾，多肽固相合成法中的3个关键点，化学工业与工程，2010，27（4）
（3）姜和，吴洋，陆荣建，多肽困难序列的研究进展，重庆理工大学学报，2011,25（5）
（4）任付平，朱立国，陈五岭，固相法合成多肽AN-M的工艺研究，现代生物医学进展，2007,7（1）
开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一．拟研究的问题
多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域非常重要的研究方法之一，可分为Merrifield和Fmoc方法，在生物药物、蛋白质工程、免疫学等研究中得到了广泛的应用。Fmoc法以Fmoc作为氨基保护基，Fmoc对酸稳定，易与碱相互作用，可用碱性化合物脱保护。
HM-3是十八个氨基酸的血管生成抑制多肽，其分子中含RGD序列具有整合素亲和性，前期研究表明其作用靶点为整合素(alpha;vbeta;3)，该抑制剂在体外实验中能显著抑制内皮细胞迁移，经体内活性筛选发现该多肽具有抑制肿瘤血管生成和显著的抗肿瘤作用，且无耐药性无明显毒副作用，该多肽在医疗行业有广阔的应用前景。但其工业合成方法不太理想，不便于大规模生产。
本课题需要对抗肿瘤多肽HM-3的合成工艺进行研究，提高合成多肽HM-3的成功率。
二．实验目的
本实验主要研究抗肿瘤多肽HM-3的固相合成工艺，提高多肽合成产量、优化合成路线，为工业化合成目的肽提供理论依据。
三．材料和仪器
1.材料和试剂
