多肽文库的合成及活性检测文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一．拟研究的问题

人血管内皮抑制素是一个很好的特征性的内源性血管生成抑制剂，其对于调节肿瘤的血管生成能力有极大的治疗潜力。而且这些治疗特性并不仅仅局限于人血管内皮抑制素的整个完整的蛋白，而是被它的一些合成的片段所共享。根据文献报道，由六个氨基酸组成的多肽片段，即R-R(G)-A-D-R-A，它们若暴露于适当的溶剂中，似乎是活泼的抗原决定基。

为探索合成相比于人血管内皮抑制素而言制备方法更简便、成本较小，活性也更好，不产生耐药性的治疗抗肿瘤的多肽药物。本课题需要合成具有一定纯度的多肽R-R-A-D-R-A和R-R-A-D-R-A多肽的衍生物，并进行活性测定。

二．实验目的

本课题拟研究合成多肽R-R-A-D-R-A的路线，并制备出具有一定纯度的多肽片段。在此基础上设计合成一些R-R-A-D-R-A多肽的衍生物，最后将所有合成的多肽进行活性测定，观察是否有抑制和治疗肿瘤的作用。

三．材料和仪器：

1.材料和试剂

2.实验仪器

a.设备

b.器材

四．实验方法

本实验采用Fmoc固相合成法合成多肽，按照如下步骤开展实验：

1、树脂的活化

取一定量的wang树脂置于固相反应器中，加入适量二氯甲烷浸泡溶胀半小时左右，减压抽去溶剂DCM。

2、氨基酸的耦联

a.在树脂上接第一个氨基酸

在树脂中加入保护氨基酸、HOBt和TBTU、DIEA、DMF，将固相反应器放入振荡器中，在342℃条件下摇荡2小时。减压抽去溶剂，以DMF洗涤树脂。

b.脱帽

用20%派啶/DMF脱帽液溶两次在振荡器中室温脱保护基团，分别为5分钟和15分钟，两次脱帽操作之后都要用DMF洗涤。脱帽操作完毕，取少量树脂在小试管内用茚三酮、苯酚及吡啶用量为2：1：1的验色剂进行验色，树脂棕黄色或绿色等，溶液蓝紫色，说明Fmoc保护金集团已被脱除，假如树脂无色，溶液很淡，则需重复上述脱帽操作直至验色通过。

c.接肽

按序列开始进行接下来氨基酸的接肽反应，与a步操作类似，在树脂中加入保护氨基酸、HOBt和TBTU、DIEA、DMF，将固相反应器放入振荡器中，在342℃条件下摇荡2小时。减压抽去溶剂，以DMF洗涤树脂。耦合完毕后，用Kaisers验色试剂进行检测，若反应呈现阳性说明耦合不完全，重复耦合步骤，直至所有氨基酸都已连接到树脂-多肽复合物上。

3.多肽的切除和沉淀

在树脂中加入切割液，密封反应两小时，抽滤将树脂与多肽分离，再加无水乙醚到切割液中将多肽析出，离心，把清液倒掉，再用无水乙醚洗涤多肽，抽干得粗品。

4.精制纯化

将粗品溶解过滤，再用制备高效液相色谱仪的C18反相柱进行分离纯化，收取合格溶液。将精制合格品溶液用旋转蒸发仪减压浓缩，除去残留溶剂和注射用水。最后用滤膜过滤，滤液装入冻干盘中，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得精制合格品。

5.检测

用质谱仪对制备产品进行鉴定

6.活性检测

用合成的多肽检测其对细胞粘附性的影响。

五．文献综述

王树脂固相合成法合成多肽

[摘要]R-R-A-D-R-A多肽是本课题组拟研究开发的一种新型抗肿瘤多肽，为保证其在活性检测中能有较好的检测结果，排除其他的因素影响，所需制备的产品必定要达到比较高的纯度。所以良好的制备和纯化过程是非常重要的，本文主要对用王树脂来固相合成多肽的方法进行阐述。

[关键词]多肽；王树脂；固相合成

1.概述

经过多年的研究与发展，多肽固相合成既克服了液相合成的费时和烦琐，又降低了由操作带来的损失，最大的优点是合成中所有的纯化步骤均以简单的冲洗和过滤完成，大大减轻提纯的难度，具有方便快捷、操作简单和产率高的优势，其优越性还表现为便于实现自动化，使其成为多肽化学合成的首选方法。固相合成多肽方法，使得多肽合成领域取得了重大突破。随着对连接分子、脱除方法和保护基的不断研究，近年来固相方法在多肽合成上的应用发展迅速。利用这一方法几乎能够高收率地制备任何多肽。多肽的固相合成有叔丁氧羰基(Boc)和芴甲氧羰基(Fmoc)两种N端保护策略。其中，Fmoc固相法已得到广泛的应用并愈加受到人们的重视。

2.原理

多肽固相合成的原理是首先对组成目的肽的氨基酸进行改造，使其成为氨基末端带有保护基的氨基酸。将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体相连，再以这一氨基酸的氨基为合成起点，使其与相邻氨基酸的羧基发生酰化反应，形成肽键。然后让包含有这两个氨基酸的树脂肽的氨基与下一个氨基酸的羧基反应，不断重复这一过程，直至目的肽形成为止。接着目的肽从树脂上裂解，进行氧化折叠，这样得到了人工合成肽的粗产品。再进行纯化，化学修饰，进行活性鉴

定。重复上述步骤，即缩合-洗涤-去保护-洗涤-缩合，直至得到目的肽链。

3.固相合成须要满足的条件

1)通常将多肽一末端键合到固相载体上，以使肽链延长

固相合成中采用的载体由两个部分组成：一部分是高分子树脂，另一部分是连接分子。这是将固相合成与传统液相合成分开来的一个重要特征，它应具有以下要求：在合成中表现为反应惰性；载体上有足够的反应位点，能使氨基酸以共价键的形式连在这些位点上，并在合成反应结束后，这种共价键能被裂解；空间位阻要小，便于溶剂的渗透，允许肽链的增长不受空间阻碍。所以正确的选择树脂与连接分子决定了固相合成的效率。

在芴甲氧羰基(Fmoc)保护策略中，多采用功能基团为羟基的树脂，与第一个氨基酸酯化，使氨基酸与树脂结合。

本实验采用传统的羟基类树脂Wang树脂，此载体通常制成1%～2%交联度的聚苯乙烯珠状树脂或微孔树脂，这样的交联度，有较大的网格空间，有利于反应物进入树脂内部，同时能容纳不断增长的肽链。它在非极性溶剂DCM和DMF中有良好的溶胀度。另外,王树脂还有机械强度好,便于振荡搅拌；耐酸耐碱的优点。

2)对暂不参与形成化学键的基团加以保护，反应完成后再脱除保护基

保护基的选择关系到产物的得率与纯度，alpha;氨基的保护基要能在温和条件下除去，同时过程中不能除去侧链上的保护基，而侧链上的保护基需要在目的肽全合成后脱去，寻找新型的保护基也是固相合成的重要部分。

1、alpha;-氨基的保护

本次实验固相合成中用Fmoc作为alpha;氨基的保护基，Fmoc对酸稳定，常用哌啶-CH2Cl2或哌啶-DMF作为脱保护剂，通过beta;-消除反应脱去，且哌啶的浓度也不需很高，以20%为宜，具有反应条件温和，副反应少，产率高，在酸处理中不受影响，操作简单，Fmoc自身具有紫外吸收易于监测，便于实现自动化等优点。

2、侧链基团的保护

要成功合成目的肽，对侧链上的活泼基团也要加以保护，以防止副反应的发生，接肽反应完成后再将保护基除去。侧链基团的保护采用半永久性保护基与alpha;氨基的保护基形成正交保护，即如果alpha;氨基采用碱敏感的保护基，侧链就采用酸敏感的保护基。侧链的氨基可采用Fmoc、Boc、对甲苯磺酰基和N-苄氧羰基进行保护，但必须与alpha;氨基的保护基的脱除敏感性相反；而侧链羧基一般以盐

或酯的形式加以保护，常用的有苄基、叔丁基等；为防Asn和Gln在alpha;羧基活化时会分子内脱水用2，4-二甲氧苄基，双-2，4-二甲氧苄基或2，4，6-三甲氧苄基来保护酰胺基；羟基最常用的保护基是苄基和叔丁基。

3)对参与形成酰胺键的羧基必须进行活化

缩合剂的选择也十分关键，直接影响到成酰胺键的速度，以及消旋化的问题等一些副反应的发生。选择一种好的缩合剂体系，可以缩短合成时间，提高合成肽纯度，确保合成肽的活性。

HOBt衍生的亚胺正离子型缩合剂，不仅可用于酰胺和酯的合成，且反应活性和抑制消旋化方面都好于脲正离子型缩合剂。最近几年来Fmoc合成法得到广泛运用，其缩合剂多采用TBTU/HOBt/DIEA为缩合剂，这种缩合剂体系明显缩短了接肽反应的时间，减少副反应发生，也有利的抑制消旋反应的出现，且有不受氨基酸种类限制的优点，是缩合剂选择的趋势。

4)用适合的试剂，将目的物质从载体上切割下来

在肽链合成后,切割试剂可有效地切除和多肽相连的树脂和侧链保护基团。

4.结语

固相合成在短肽上的合成具有无法比拟的优越性，但对大分子肽段、酸碱敏感的肽和存在空间结构的短肽合成中，固相合成就略显不足，固相载体的结构会对长肽合成产生位阻，影响肽链延长，故常采用的是分步合成法，但随着肽链变长，合成纯度会下降；现常用酸碱作为脱保护试剂，对酸碱敏感的肽类合成不利；而有空间结构的短肽，很难形成正确的折叠，阻碍反应的进行。且需注意的是在固相合成肽反应中，第一个氨基酸与树脂的连接反应尤为重要，它直接影响到最终产品的产率、纯度及合成成本。因此第一个氨基酸的合成条件在本次实验中需格外注意，仍需做一些探索，力求达到较高的产率和纯度。

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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一．拟研究的问题

人血管内皮抑制素是一个很好的特征性的内源性血管生成抑制剂，其对于调节肿瘤的血管生成能力有极大的治疗潜力。而且这些治疗特性并不仅仅局限于人血管内皮抑制素的整个完整的蛋白，而是被它的一些合成的片段所共享。根据文献报道，由六个氨基酸组成的多肽片段，即R-R(G)-A-D-R-A，它们若暴露于适当的溶剂中，似乎是活泼的抗原决定基。

为探索合成相比于人血管内皮抑制素而言制备方法更简便、成本较小，活性也更好，不产生耐药性的治疗抗肿瘤的多肽药物。本课题需要合成具有一定纯度的多肽R-R-A-D-R-A和R-R-A-D-R-A多肽的衍生物，并进行活性测定。

二．实验目的

本课题拟研究合成多肽R-R-A-D-R-A的路线，并制备出具有一定纯度的多肽片段。在此基础上设计合成一些R-R-A-D-R-A多肽的衍生物，最后将所有合成的多肽进行活性测定，观察是否有抑制和治疗肿瘤的作用。

三．材料和仪器：

1.材料和试剂