构建VEGF和人绒毛膜促性腺激素hCG的融合蛋白及其功能相关研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一．研究问题：

血管是组织生长和存活的基础要素，血管内皮生长因子（VEGF）是一种重要的血管新生因子，是促进血管生长作用最强的关键因子之一，是诱导血管生成的主要调节因素。目前共发现有五种哺乳动物VEGF配体和三种VEGF酪氨酸激酶受体，一些共受体还可间接的调节VEGF的生物学效应。VEGF在正常组织和肿瘤组织中的表达有显著差异，在肿瘤的发生发展中具有重要作用，为肿瘤的治疗提供了新的作用靶点。

正常情况下成人组织细胞的胚胎基因处于静息状态，不表达或仅表达极其微量的hCG，当细胞发生恶性转化时，静息的胚胎基因被激活而表达。但良性肿瘤细胞一般不表达异位hCG，分化程度越低的肿瘤表达越高；而且对肿瘤生长、和逃避免疫系统攻击起重要作用。因此当前普遍认为恶性肿瘤细胞表达异位hCG为一种返祖现象，与胚胎或胎儿细胞在生物学特性上存在许多相似的生物学特征，异位hCG是癌细胞转化的产物，并不是肿瘤形成的原因。可以说hCG并不诱发肿瘤的发生，但肿瘤一旦形成就会表达异位HCG，模拟胚胎发育模式促进自身生长。

本课题利用PCR方法从实验室已构建的VEGF2和HSP65-X10-beta;hCGCTP37重组质粒中扩增两段目的片段（VEGF121-M2和X10-beta;hCGCTP37），再逐个插入pET-28a载体中，构建出融合蛋白的重组片段。将重组载体转化进入宿主菌，筛选阳性克隆。通过重组后的工程菌表达融合蛋白，用以制备抗肿瘤疫苗。利用融合蛋白免疫动物后观察其抗肿瘤活性。

二．研究手段：

2.1重组质粒的构建

利用实验室已经构建的VEGF2和HSP65-X10-beta;hCGCTP37重组质粒中片段信息设计引物，利用PCR将目的片段VEGF121-M2和X10-beta;hCGCTP37扩增出来。并用双酶切的方法将这两个片段逐个插入pET-28a载体中，构建出融合蛋白的重组片段。

2.2转化及其检测

用钙转法将已经做好的重组质粒转入大肠杆菌中，并利用空载体做对照试验，在加入了卡那霉素的固体培养基上培养。筛选出阳性克隆并接种到液体培养基中进行培养过夜后，取质粒，利用酶切进行初步验证后测序，测序结果比对正确后进行第二步克隆。利用前面构建的重组质粒载体和PCR获得的beta;HCG目的片段按照上述步骤获得最终的重组质粒，再用PCR初步验证后送测序，测序比对正确后构建完成。