1. 研究目的与意义
自50 年代末，Bender 等首先对出芽茁霉(pullularia pullulans)——一种不完全菌产生的粘多糖普鲁兰(又称茁霉多糖)的结构进行了研究，发现这是一种以α-1 , 6 糖苷键将麦芽三糖头尾相连而形成的多糖。1961 年，Bender 等进一步发现由产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)所产生的细胞外酶———普鲁兰酶(又称茁霉多糖酶)可以切断普鲁兰中的α—1 , 6糖苷键，而使普鲁兰转化成麦芽三糖。普鲁兰酶能够专一催化支链淀粉型多糖α-1 , 6 糖苷键的水解，从而使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链形成一系列链长不一的直链淀粉。将该酶与葡萄糖淀粉酶等配合使用，可使淀粉充分糖化。国内目前使用的普鲁兰酶基本上都是来自丹麦Novo No rdisk 公司，该公司所产的普鲁兰酶则是由普鲁兰杆菌(bacillus acidopulluly ticus)菌株经深层发酵产生。
普鲁兰酶主要使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链，从而加速糖化过程，有效的提高淀粉利用率和水解效率，降低能耗。在食品领域，通常与淀粉酶结合使用，生产果糖和麦芽糖糖浆。当普鲁兰酶以普鲁兰糖为原料时，水解产物主要是麦芽三糖糖浆，其在食品工业中有重要应用价值，与麦芽糖浆、葡萄糖浆等相比，其优势主要体现在：抑制食品的冰点凝固、赋予柔和的甜度、增加持水性、防止淀粉重结晶、减少色素形成等。因此，普鲁兰酶可以在焙烤食品、甜点以及医药注射代替葡萄糖等领域中应用，在生物能源方面，以淀粉等生物质资源开发乙醇、丁醇等生物燃料也是当前能源开发的热点，这说明普鲁兰酶具有广泛的工业应用价值。
普鲁兰酶广泛分布于丝状真菌、细菌、酵母、植物和动物中，如芽孢杆菌，厌氧芽孢杆菌，水栖热袍菌，巴伦葛兹类芽孢杆菌。然而，由于酶在产量、稳定性及特殊环境下的活性等局限，用于工业化生产的普鲁兰酶非常有限。
目前，很多研究报道了不同特性的普鲁兰酶，如嗜热栖热菌来源的耐热性达到70 ℃的普鲁兰酶；来源于嗜碱芽孢杆菌的耐受表面活性剂的普鲁兰酶。虽然有不同特性的普鲁兰酶报道，但是特性单一，不能满足对多种特性需求的工业化生产需要，如目前淀粉糖化过程一般在60 ℃高温和pH4.5 的弱酸性条件下进行48～60 h，在此过程中普鲁兰酶不仅要维持高的催化活性还要保持高稳定性，而根据文献，符合这种多元化条件的普鲁兰酶非常有限。
本文通过对稻田普鲁兰酶产生菌的筛选与鉴定，为后期对普鲁兰酶的性质及动力学常数的研究奠定了基础。
2. 研究内容和预期目标
1. 稻田普鲁兰酶产生菌的筛选
2. 稻田普鲁兰酶产生菌的初步鉴定
3. 研究的方法与步骤
1 实验材料
1.1 土壤来源：稻田土壤样品。
1.2 药品与试剂：
糯米淀粉，玉米淀粉，蛋白胨，酵母膏，琼脂，普鲁兰糖，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，七水合硫酸镁，硫酸铵，硫酸亚铁，氯化钠，DNS试剂，碘试剂，磷酸缓冲液等。
1.3 培养基的制备
种子培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠 5.0g，加水溶定容至1000mL，pH6.0。
发酵培养基：玉米淀粉20.0g，酵母膏10.0g，磷酸二氢钾1.0g，七水合硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，加水容溶至1000mL,pH6.0。
鉴别培养基：氯化钠2.0g，酵母膏2.0g，蛋白胨10.0g，普鲁兰糖3.0g，琼脂25.0g,加水定容至1000mL,pH7.0。
分离平板培养基：糯米淀粉25.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏5.0g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，七水合硫酸镁0.01g，琼脂25.0g，加水定容至1000mL，pH6.0。
培养基灭菌条件：高压蒸汽灭菌锅121℃，灭菌20min。
2 实验方法
2.1 菌种的筛选
2.1.1 土壤样品的预处理
样品在采集时均用无菌塑料袋或小瓶封装，编号后4℃保存。
2.1.2 菌种分离初筛方法
称取土样5g至45mL无菌生理盐水中，加入玻璃珠充分震荡后静置1h，取土样上清液和水样100μL于试管中，做梯度稀释，取适宜的稀释度涂板，于恒温培养箱中30℃培养48h，在分离平板中滴加浓度为1%的碘液适量，挑取有透明圈者，划线分离纯化，30℃培养24h，把有透明圈的菌株转入鉴别培养基，于温箱中培养48h后，挑选出较好的菌株继续纯化两次，作为复筛对象。
2.1.3 菌种的复筛
将初筛得到的纯化后的菌株，少量挑取，加入装有20mL种子培养基的锥形瓶中30℃培养16h，再将种子培养液倒入装有40mL发酵培养基的锥形瓶中，置于回转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200r/min,30℃发酵48h，测定发酵液中普鲁兰酶活力。
2.1.4 菌种的保藏
从30℃条件下培养3天的平板上挑细菌的单菌落接种于分离培养基的斜面上保藏。
2.2 菌种的初步鉴定
2.2.1普鲁兰酶活力的鉴定
DNS比色法：向洁净的离心管中加入各处理菌丝的上清液200 μL，加入400 μL DNS，沸水浴5 min。取出立即放入冷水浴中，冷至室温，蒸馏水定容至2.5 mL，混匀于波长540nm下测OD值。同时制作0~2000 μg/mL葡萄糖标准曲线，再根据OD值换算葡萄糖含量（μg）。
（1）葡萄糖标准曲线的制备
取7支20mL具塞试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液，蒸馏水和DNS试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。摇匀，在沸水浴中加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL,加塞后摇匀，在波长540nm的分光光度计上测出光密度至汇出标准曲线。
表1
| 管号 | 1 mg/mL葡萄糖标准液（mL) | 蒸馏水（mL) | DNS(mL) | 葡萄糖含量（mg） | 光密度值（OD) |
| 0 | 0 | 2 | 1.5 | 0 |
|
| 1 | 0.2 | 1.8 | 1.5 | 0.2 |
|
| 2 | 0.4 | 1.6 | 1.5 | 0.4 |
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| 3 | 0.6 | 1.4 | 1.5 | 0.6 |
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| 4 | 0.8 | 1.2 | 1.5 | 0.8 |
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| 5 | 1.0 | 1.0 | 1.5 | 1.0 |
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| 6 | 1.2 | 0.8 | 1.5 | 1.2 |
|
2.2.2普鲁兰酶蛋白的测定
考马斯亮兰G-250染色法：取洁净试管，加入菌丝处理上清液100 μL，用蒸馏水定容至1 mL，再加入5mL考马斯亮兰G-250溶液，静置5 min，于波长595 nm下测OD值。同时以0~100μg/mL牛血清蛋白溶液代替菌丝处理液制得标准曲线，再根据OD值换算菌丝处理液中蛋白的含量（μg）。
（1）考马斯亮蓝标准曲线制备
取7 支试管，分别加入0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL标准蛋白溶液，用蒸馏水补足1mL，取8支试管，0号管加入0.1mL蒸馏水，1-7号管依次加入0.1mL的标准蛋白溶液，然后加入5mL蛋白质染色剂，充分振荡混合，10min后于595nm测定吸光值绘制标准曲线。
2.2.3紫外诱变对普鲁兰酶活力的影响
取5支试管，编号，每管分别制备1mL菌悬液，稀释，取10mL到无菌空平板中，放入一个70%消毒的转子，在15W的紫外灯下进行紫外诱变（紫外灯预热30min），分别照射0s，5s，10s，20s，30s，40s，取1mL诱变液稀释6次后取3-6次的稀释液0.1mL到含培养基的平板中，包黑纸，37℃过夜，计数，计算致死率，再进行酶活与酶蛋白的测定，与之前的进行比较。
2.2.4pH对菌种酶活的影响
在相同的发酵培养基不同初始pH条件下接种等量种子液，在相同培养条件下培养72h，测定发酵液的酶活，进行比较。
2.2.516S rRNA测定
确定所得普鲁兰酶产生菌菌株所属的生物分类学分支。
3 结果与分析
根据所得数据用Excel处理数据。
4. 参考文献
[1] bender h, lehmann j, wallenfels k.pullulan, an extracellular g lucan from pullularia pullulans [j]. biochim biophys acta, 1959, (36): 309-316
[2] bender h, wallenfels k. untersuchungen and pullulan.Ⅱ, spezifischer abbau durch ein bakterielles [j]. enzym biochem z, 1961, (334): 79-95
[3] 高涛, 王芳, 别小妹, 等. 产耐热普鲁兰酶菌株的分离、筛选与鉴定[j]. 食品科学, 2017, ( 8) : 117-121.
5. 计划与进度安排
1、2022-2022-1学期17-20周～2019-2022-2学期1-4周（2022年12月23日—2020年3月20日），接受任务、查阅和翻译文献，撰写开题报告；
2、第5周~第6周（2022年3月23日～2022年4月3日），完成实验前准备工作，配制各实验所需药品。
3、第7周~第8周（2022年4月6日～2022年4月17日），预实验
