分枝杆菌KshA对AD转化的关键位点预测研究开题报告

1. 研究目的与意义

研究背景

甾体药物是用量仅次于抗生素的第二大类药物，在医疗和健康领域具有广泛的应用。甾体药物对机体起着重要的调节作用，具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克的药理作用，能够改善蛋白质代谢、恢复并增强体力以及利尿降压，甾体类药物在临床中常用于治疗过敏性疾病、风湿性关节炎、避孕及手术麻醉等。截止目前，全球获准上市的甾体药物约有400余种。

甾体药物的生产方法主要有化学法和生物法。生物法生产甾体的过程绿色环保，产率高，副产物少，反应选择性高。当前甾体工业的初始原料正在由从黄姜等植物中提取的薯蓣皂素转变为油脂工业的下脚料植物甾醇。其中，雄烯二酮(ad)是甾体药物生产中的关键中间体。将ad进一步羟化制备获得的9-ohad，是氢化可的松、泼尼松龙等药物的重要前体。利用微生物法将ad转化为9-ohad具有高立体选择性、绿色环保等优点，已逐渐在9-oh的生产中发挥着主要的作用。自20世纪40年代发现有微生物可以降解植物甾醇以来，已有多种微生物报道可以降解植物甾醇得到雄烯二酮 (androstenedione, ad) 等化合物，如：分枝杆菌 (mycobacterium sp.)、红球菌 (rhodococcus sp.)、诺卡氏菌 (norcardia sp.)和假单胞菌 (pseudomonas sp.)[6-7]等。在20世纪60–90年代，科研人员通过传统诱变筛选技术和添加抑制剂抑制关键酶 活力等方法，开发了一系列制备ad、雄二烯二酮 (androstadiendione, add)、9α-羟基-雄烯二酮 (9α-hydroxy-androstenedione, 9α-oh-ad)和谷内 酯 (sitolactone, hil)的菌株及转化工艺，这些化合物是合成甾体药物的关键中间体，全球年需求量约3000t。但由于甾体代谢途径复杂，中间代谢产物和副产物众多，且甾体化合物性质相近，难以分离纯化，导致 ad、add 等重要甾体药物核心原料价格高昂，使得我国 甾体药物关键原料一直依赖黄姜种植、从薯蓣皂素合成甾体药物原料药的格局没有被打破。而目前金色分枝杆菌（mycobacterium neoaurum）是目前最常见的甾体药物中间体制备微生物，其中能够将ad转化为9-ohad的酶是甾体酮羟化酶ksh，由ksha和kshb两部分组成。

2. 研究内容和预期目标

研究内容

本研究拟以分枝杆菌ksha为基础，通过可视化分析获得其中可能影响酶与底物结合的关键位点，对其进行虚拟突变，并对突变体进行三维同源建模，将建好的模型与底物进行对接分析，并利用分子动力学模拟对结果进行进一步分析，为后续实验突变进行理论探索。本研究的目主要内容是确定金色分枝杆菌ksha中对ad转化为9-ohad起关键作用的位点，并对其位置和突变方向进行预测。首先对ksha进行模型建立，随后利用多种软件对三维模型进行可视化分析，选取突变位点及突变方案，进行虚拟突变，最后利用分子对接和分子动力学模拟对突变进行分析和预测，完成突变方案评价。

预期目标

3. 研究的方法与步骤

研究方法

本课研究采用的方法为虚拟突变(virtual mutagenesis)，同源建模(homology modeling)和分子对接(molecular docking)。主要步骤包括：

一、分子建模采用swiss- model服务器（http://swissmodel.expasy.org/），通过序列搜索获得覆盖率和相似度较高的模板，以该模板产生三维结构，对所产生结构的评价采用拉氏图进行，对所产生结构的优化采用moe软件中的amber ff10力场进行。

4. 参考文献

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5. 计划与进度安排

1）2024-12～2024-02：查阅文献资料，撰写开题报告。
2）2024-02～2024-03：通过可视化分析选取突变位点，实施虚拟突变，并建立突变体的三维模型。
3）2024-03～2024-04：对突变体与底物结合进行对接分析和动力学分析。
4）2024-04～2024-05：分析实验结果，整理实验数据，撰写实验论文，准备答辩。