三山岛湿地公园浮游细菌群落结构研究开题报告

1. 研究目的与意义

一、研究背景

太湖三山岛湿地公园位于吴中区东山镇三山岛，以泽山岛、厥山岛、蠡墅岛和三山岛本岛岸线外扩200米为四至边界，呈不规则的马蹄形，是我国太湖湖滨湿地中重要的组成部分之一。湖滨湿地是连接湖泊水体和陆地之间的连接带，在水生生态系统的循环中具有关键作用。但是近年来随着经济和人口的不断上升，湖泊的水体富营养化已经成为危害水生生态系统和人体健康的重大问题，在水体中关键的营养因素氮和磷因人类活动而发生了巨大的改变。氮和磷的过度富集是加速了水体富营养化和太湖水华的主要原因。

研究表明，湿地水体浮游细菌群落对改善水体富营养化和水生生态系统的生态平衡具有重要意义，是湿地水生态系统功能评价的重要部分，同时其生物量及群落多样性对环境变化敏感、响应快，且对潜在的环境威胁具有预警作用，在一定程度上指示了湿地生态系统的健康状况。因此，对于湿地浮游细菌群落进行系统考察是完善湿地生态健康状况监控的重要部分。

2. 研究内容和预期目标

本论文拟通过样本的dna提取，运用高通量测序分析水体中浮游细菌群落结构，并对水样的溶氧量、ph 值、浊度、总氮、总磷含量进行水质指标测定，最后对所得数据进行统计和分析。

一、研究内容

（1）对所收集到的水样进行水质理化指标测定。其中浮游植物样品的采集与水质理化指标测定参考《水和废水监测分析方法》（第四版）的有关要求。

3. 研究的方法与步骤

一、研究方法

1、温度、pH 值、浊度及 DO 值于采样点现场测定，pH 值、浊度及 DO值的测定采用水质分析仪(YSI556-MPS, YSI, 美国)

2、CODcr，总氮及总磷含量于样品运回实验室当天测定，CODcr 测定采用快速消解分光光度法 （HJ／T399-2007）,测总氮采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法，总磷测定采用钼酸铵分光光度法(GB 11893-1989)

3、利用DNA提取试剂盒对水样进行宏基因组提取。

4、运用高通量测序技术对宏基因组进行分析和处理。

5、对数据进行分析和处理

一、研究步骤

1、采集水样

本研究样本采自三山岛湿地公园，共设置三个平行三个采样点，每次样本采集以边长10 m的等边三角形顶点进行三点采样，采样深度为水面下 0.5 m 处，分别装入1 L无菌聚乙烯塑料瓶中，置于低温冷藏箱并于当天运回实验室。

2、测PH值、浊度、溶氧量及透明度

均于采样点原位测定，使用YSI556 － MPS水质分析仪（美国 YSI 公司）来测量浊度和溶氧量，PH值采用玻璃电极法，透明度测定采用沙氏圆盘法。

3、运用快速消解法（HJ／T399-2007）测COD

（1）试剂和材料：

① 水（5.1）,应符合 GB/T6682 一级水的相关要求

② 硫酸：ρ（H₂SO₄）＝ 1.84g/ml

100ml硫酸 （5.2）沿烧杯壁慢慢加入到 900ml水中，搅拌混匀，冷却备用。

③ 硫酸溶液（1 9）

将50g硫酸银加入到 500ml硫酸 （5.2）中，静置 1-2d，搅拌，使其溶解。

④ 重铬酸钾（K₂CrO₇）：优级纯

⑤ 重铬酸钾标准溶液

⑥ 预装混合试剂，按表１的要求加入重铬酸钾溶液、硫酸汞溶液和硫酸银－硫酸溶液，拧紧盖子，轻轻摇匀，冷却至室温，避光保存。在使用前应将混合试剂摇匀。配制不含汞的预装混合试剂，用硫酸溶液（5.3）。

⑦ COD标准贮备液

低量程 （测定上限 150mg/l）COD标准系列使用溶液：COD 值分别为25mg/L、50mg/L、 75mg/L、100mg/L、125mg/L和150mg/L。 分别量取10.00mL、20.00ml、30.00ml、40.00ml、50.00 ml和 60.00 ml COD标准贮备液 （5.10.3） 加入到相应的250ml 容量瓶中，用水（5.1）稀释至标线，摇匀。此溶液在2～8℃下贮存，可稳定保存一个月。

⑧ 消解管

当消解管作为比色管进行光度测定时，应从一批消解管中随机选取5～10 支，加入５ml水(5.1)，在选定的波长处测定其吸光度值，吸光度值的差值在±0.005之内。消解管用于测定的部位不应有擦痕和粗糙；在放入光度计前应确保管子外壁非常洁净。

（2）测定步骤

① 打开加热器，预热到设定的165℃±２℃

② 选定预装混合试剂(5.8),摇匀试剂后再拧开消解管管盖。

③ 量取相应体积的COD标准系列溶液（试样）沿到管内壁慢慢加入到管中。

④ 拧紧消解管管盖，手执管盖颠倒摇匀消解管中溶液，用无毛纸擦净管外壁。

⑤ 将消解管放入165℃±２℃加热器中，加热15min。

⑥ 从加热器中取出消解管，待消解管冷却至60℃左右时，手执管盖颠倒摇动消解管几次，使管内溶液均匀，用无毛纸擦净管外壁，静置，冷却至室温。

⑦ 低量程方法在440nm±20nm波长处，以水(5.1)为参比液，用光度计测定吸光度值

⑧ 低量程COD标准系列使用溶液COD值对应空白试验测定的吸光度值减去其测定的吸光度值的差值，绘制校准曲线。

⑨ 空白实验

用水代替试样，按照之前步骤测定其吸光值，空白实验与试样同时测定。

⑩ 试样的测定

若消解管底部有沉淀影响比色测定时，应小心将消解管中上清液转入比色（皿）中测定。

（3）结果计算

在440nm±20nm波长处测定时，水样COD的计算：

ρ（COD）=n［k（A_b-A_s）＋a］

ρ（COD）———水样COD值，单位为mg/L；

ｎ———水样稀释倍数；

ｋ———校准曲线灵敏度，单位为（mg/L）／１；

Ａｓ———试样测定的吸光度值，单位为１；

Ａｂ———空白试验测定的吸光度值，单位为１；

ａ———校准曲线截距，单位为 mg/L。

注：COD测定值一般保留三位有效数字。

4、测总磷（钼锑抗分光光度法）

（1）试剂配制

① （1 1）硫酸，

② 10%抗坏血酸溶液：溶解10g抗坏血酸于水屮，并稀释至lOOmL该溶液贮存在棕色玻璃瓶中，在约4℃可稳定几周，如颜色变黄，则弃去重配。

钼酸盐溶液：溶解13g钼酸铵于100ml水中。溶解0.35g酒石酸锑氧钾于100ml水中。在不断搅拌下将钼酸铵溶液徐徐加到300ml（1 1）硫酸中，加酒石酸锑氧钾溶液并且混合均匀，贮存在棕色的玻璃瓶中于约4℃保存。至少稳定两个月。

③ 浊度-色度补偿液：混合两份体积的（1 1）硫酸和一份体积的10%抗坏血酸溶液。此溶液当天配制。

④ 磷酸盐贮备溶液：将优级纯磷酸二氢钾（KH₂PO₄）于110℃干燥2h,在干燥器中放冷。称取0.217g溶于水，移入1000ml容量瓶中，加（1 1）硫酸5ml,用水稀释至标线。此溶液每毫升含50μg磷。

⑤ 磷酸盐标准溶液：吸取10.00ml磷酸盐贮备液于250ml容量瓶中，用水稀释至标线, 此溶液每毫升含2.00μg磷。临用吋现配。

（2）测定步骤

① 校准曲线的绘制

取数支50ml具塞比色管.分别加入磷酸盐标准使用液0、0.50、1.00、3.00、5.00、10.0、15.0ml,加水至50ml。

显色：向比色管中加入1ml 10%抗坏血酸溶液，混匀-30s后加2ml钳酸盐溶液充分混匀，放置15min。

测量：用10mm或30mm比色皿，于700nm波长处，以零浓度溶液为参比，量吸量光度。

② 样品测定

分取适量经滤膜过滤或消解的水样（使含磷量不超过30μg）加入50ml比色管中，用水稀释至标线。以下按绘制校准曲线的步骤进行显色和测量。减去空白试验的吸光度，并从校准曲线上查出含磷量。

③ 计算

磷酸盐（P, mg/L）=m/v

式中：

m—由校准曲线表得的磷量（μg）;

V-—水样体积（ml）。

5、测总氮（过硫酸钾氧化 紫外分光光度法）

（1）试剂

① 无氨水：每升水中加入O.lml浓硫酸，蒸馏。收集馏出液于玻璃容器中或用新制备的去高子水.

② 20%氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠，溶于无氨水中，稀释至lOOmL

③ 碱性过硫酸钾溶液：称取40g过硫酸钾, 15g氢氧化钠，溶于无氨水中, 稀释至1000ml溶液存放在聚乙烯瓶内，可贮存一周.

④ （1 9）盐酸

⑤ 硝酸钾标准溶液

标准贮备液：称取0.7218g经105-110℃烘干4h的优级纯硝酸钾溶液无氨水中，移至1000ml量瓶中，定容。此溶液每亳升含100g硝酸盐氮。加入2ml三氯甲烷为保护剂，至少可稳定6个月。

硝酸钾标准使用液：将贮备液用无氨水稀释10倍而得。此溶液每毫升含10μg硝酸盐氮。

（2）测定步骤

① 校准曲线的绘制

分别吸取0、0.50. 1.00、2.00. 3.00、5.00、7.00、8.00ml硝酸钾标准使用溶液25ml比色管中,用无氨水稀释至10ml标线。

② 加入5ml碱性过硫酸钾溶液，塞紧磨口塞，用纱布及纱绳裹紧管塞，以防迸溅岀。

③ 将比色管置于压力蒸汽消毒器中，加热0.5h,放气使压力指针回零。然后升温至 120-124℃开始计时（或将比色管置于民用压力锅中，加热至顶压阀吹气开始计时）.使比色管在过热水蒸气中加热0.5h。

④ 自然冷却，开阀放气，移去外盖，取出比色管并冷至室温。

⑤ 加入（1 9）盐酸1ml,用无氨水稀释至25ml标线。

⑥ 在紫外分光光度计上，以无氨水作参比，用10mm石英比色皿分别在220nm及275nm 波长处测定吸光度。用校正的吸光度绘制标准曲线。

⑦ 样品测定步骡

取10ml水样，或取适量水样（使氮含只为20-80μg）。按校准曲线绘制步骤②至⑥操作。然后按校正吸光度，在校准曲线上査出相应的总氮量，再用下列公式计算总氮含量。

总氮（mg/L）= m/v

式中：

m----从校准曲线上査得的含氮量（μg）

V----所取水样体积（ml）。

6、103-105℃烘干的总残渣

（1）仪器

① 全玻璃或有机玻璃微孔滤膜过滤器，

② 滤膜，孔径0.45μm,直径45-60nm

③ 吸滤瓶，真空瓶。

④ 称量瓶。

（2）步骤

① 滤膜准备

用扁嘴无齿微子夹取滤膜放于事先恒重的称量瓶里，移入烘箱中于103-105℃烘干 0.5h后取出置干燥器内冷却至室温，称其重量反复烘干、冷却、称量，直至两次称重的重量差小于0.2mg。将恒重的滤膜正确地放在滤膜过滤器的滤膜托盘上，加盖配套的漏斗， 片用夹子固定好。以蒸馏水湿润滤膜，并不断吸滤。

② 测定

量取充分混合均匀的试样100ml抽吸过滤。使水分全部通过滤膜。再以每次10ml蒸馏水连续洗涤三次，继续吸滤以除去痕量水分。停止吸滤后，仔细取出载有悬浮物的滤膜放在原恒重的称量瓶里，移入烘箱中于103105°C下烘干lh后移入干燥器中，使冷却到室温，称其重量反复烘干、冷却、称量，直至两次称量的重量差小于0.4mg为止。

计算

悬浮物含量C (mg/L)按公式计算：

C=(A-B)x10⁶/ V

式中：

C——水中悬浮物含量(mg/L)；

A——悬浮物 滤膜 称量瓶重量(g);

B——滤膜 称量瓶重量(g):

V-—试样体积(ml)。

7、DNA提取

量取每组平行样品各200 mL，充分混合后使用 0.22 μm 无菌滤膜进行抽滤,剪取0.5 g带有菌体的滤膜进行宏基因组提取:采用 PowerSoilDNA 提取 试剂盒，操作步骤参照说明书。每份样本设置 2 个平行，分别提取后等体积混合。对DNA 浓度和质量进行测定，分装并冻存于-80 ℃。

8、16S rＲNA 基因片段扩增及高通量测序

将提取的宏基因组样本寄送至上海美吉生物医药科技有限公司进行 16S rＲNA 基因片段的扩增及高通量测序，引物采用 16S rRNA基因 V3－V4 区通用引物338F/806R,并在每组引物 5’端加上18 bp 条码序列以区分样本。

20μL 扩增反应体系:预混液10μL;上下游引物各1μL(10μmol/l);模板DNA2μL( 统一稀释至 10 mg /L) ; ddH₂O7μL。扩增反应程序: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 20 s,56 ℃20 s,72 ℃ 20 s，共 25个循环; 72 ℃ 5 min。每份样本 DNA 设置两组平行分别进行文库构建，扩增产物等体积混合后加载至 IlluminaMiSeqBenchtop 测序仪进行测序。

9、数据统计和分析

使用 QIIME v1.9.0 软件对 16S rDNA 扩增子测序数据进行质控、OUT 划分、分类学地位注释及多样性指数计算。具体参数为碱基准确率大于 99.9%，序列长度大于 450 bp，融合区碱基错配率小于 10%。将各样本质检合格的序列数抽平至 20 000，划分 OTU时相似度阈值为 97%；将各 OTU 代表序列比对 SILVA 数据库(https://www.arb-silva.de/)，以 80%置信度进行分类学地位注释。多样性指数计算时舍弃序列数≤5的 OTU。

聚类分析、冗余分析(redundancy analysis, RDA) 通过 Rv3.3.1 软件完成，运用 LEfSe (linear discriminant analysis effect size)分析确定标志微生物(Segata et al., 2011)。

4. 参考文献

[1] 冯胜, 秦伯强, 高光. 细菌群落结构对水体富营养化的响应[j]. 环境科学学报, 2007,27(11):1823-1829.

[2] hutchinson g e. theparadox of the plankton[j]. american naturalist, 1961, 95(882):137-145.

[3] kathol m, norf h ah, weitere m. effects of temperature increase on the grazing of planktonic bacteria by biofilm-dwelling consumers.[j]. aquatic microbial ecology, 2009,55(1):65-79.

5. 计划与进度安排

1、2022-2022-1学期11-19周～2022-2022-2学期第1周～第2周（2022-11-4～2022-3-8），查阅资料，准备开题报告，外文论文翻译；

2、第3周～第6周（2022-3.9～4.5），完成实验前准备工作，配制各实验所需药品；

3、第7周～第8周（2022-4.6～4.19），预实验，样品采集；