1. 研究目的与意义

酸雨是我国现阶段面临的严重问题。我国酸雨面积已占国土面积的40%，成为继欧洲和北美之后的第三大酸雨区。苏州是江苏酸雨发生频次和程度最严重的地区。研究表明，仅在我国酸雨污染比较严重的江苏、浙江、安徽等11个省、自治区，酸沉降引起的森林木材储蓄量减少和农作物减产所造成的直接经济损失每年分别高达44亿和51亿人民币。

酸雨对陆地生态系统中植被的危害及影响已有大量报道，寻求作物免于酸雨危害主要集中在稀土元素、钙硅离子等提高作物抗逆性的研究，而植物生长调节剂对酸雨胁迫的缓解机理尚未见报道。本实验通过酸雨胁迫下水稻的生理效应研究，探讨稀土微肥对酸雨胁迫下水稻幼苗期的防护与修护作用。

2. 研究内容和预期目标

一、主要研究内容

本课题以苏州地区优质地产水稻苏香粳3号为研究对象，利用含有稀土的稀土微肥对生长到一定阶段15天左右，实验分三组进行处理：第一组为对照组喷施酸雨，第二组为防护组模拟酸雨前喷施稀土，第二组为修复组模拟酸雨后喷施稀土。研究指标如下：过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧物歧化酶、氧自由基产生速率、硝酸还原酶、丙二醛含量、质膜透性、叶绿素含量等的测定，通过分析这八个指标来分析稀土微肥对酸雨胁迫下水稻幼苗期防护与修复作用，从而进行比较。

二、预期目标

3. 研究的方法与步骤

一．过氧化物酶活性的测定

（1）粗酶液的提取

称取苏香梗3号叶片1g，加5ml20mmol/LKH₂PO₄，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min,收集上清液保存在冷处，残渣再用5mlKH₂PO₄溶液提取一次，合并两次上清液。

（2）酶活性的测定

取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3ml，KH₂PO₄1ml，作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可适当稀释），立即开启秒表计时，与分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次，以每分钟OD变化值表示酶活性大小，即以 ΔA470 /[min g （鲜重）]表示。蛋白质含量测定按Folin法进行。

二、过氧化氢酶活性（紫外吸收法）

（1）酶液提取 同滴定法

（2）测定 取10ml试管3支，其中1支为对照管，2支为处理管

三、邻苯三酚自氧化法（超氧化物歧化酶活性）

制备提取液 水稻叶片经表面消毒，蒸馏水浸泡4-5h，每克鲜重加入2-3mL提取液研磨。13000r/min冷冻离心20min,收集上清液，加入硫酸铵并收集30%-50%饱和度的沉淀。小体积蒸馏水复溶，透析去盐，为超氧化物歧化酶液。

自氧化率测定 在一系列20mL试管中各加9mLTris-HCl缓冲液工作液，于25℃水浴20min，精确加入40L于25℃预热的邻苯三酚溶液，立即混匀，于25℃准确保温3min。加入50L维生素C溶液，以终止邻苯三酚自氧化反应，倒入1cm光径比色杯。以9mL Tris-HCl缓冲液工作液作空白溶液，于1h内读取420nm处OD值(Ao)。

酶活性测定 在Tris-HCl缓冲液工作液中预先加入一定量待测SOD稀释液，用上述方法测定样品420nm处OD值（As），但注意不加自氧化终止剂维生素C。、

抑制率=(Ao-As)/Ao100%

SOD单位活力=[(Ao-As)/(Ao0.5)]N/V

V为加样体积 N为样品稀释倍数 0.5即抑制自氧化反应50%

四、氧自由基产生速率的测定

制作标准曲线 亚硝酸根标准曲线的制作：用100mol/L NaNO2(7mg/L)母液配制0、5、10、15、20、25、30mol/L NaNO2各2ml，分别加入2ml对氨基苯磺酸和2ml α-萘胺，于

25℃中保温20min,然后测定OD530，以[NO2－]和测得的OD530值互为函数作图，制得亚硝酸根标准曲线

植物提取液的制备 取上述植物组织2g，加50mmol/L磷酸缓冲液（PH7.8）2mL，充分研磨，10000r/min离心20min,上清液定容至3mL，此液即为O2－产生待测液。

O2－产生速率的测定 0.5mL样品提取液中加入0.5mL 50mmol/L磷酸缓冲液，1.5mL的1mmol/L盐酸羟胺，摇匀，于25℃中保温1h，然后再加入2mL17mmol/L对氨基磺酸和2mL7mmol/L ɑ-萘胺，混合，于25℃中保温20min，取出以分光光度计测定波长530nm的OD值。

结果计算 O2－产生速率=（cVN）2/(mt) N为4，V是30.001L，m为鲜重， t 为60min

五、硝酸还原酶活性的测定----活体法

1.新鲜取回的叶片（苏香粳3号）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔气钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2-3次，吸干水分，然后于天平上称取等重的叶子圆片两份，每份0.3-0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：（1）0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液5mL 蒸馏水5mL；（2）0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液5mL 0.2mol/L KNO₃ 5mL。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后圆片即沉入溶液中。将三角烧瓶置于30℃温箱中，避光保温作用30min，然后分别吸取反应液1mL,以测定NO₂^- 含量。

注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以累积糖类，如果组织中糖类含量低，会使酶活力降低，此时则可在反应溶液中加入30g 3-磷酸甘油醛或1,6-二磷酸果糖，能显著增加NO₂^- 的产生。

2.NO₂^- 含量的测定

保温30min结束后，吸取反应液1mL于一试管中，加入磺胺试剂2mL，混合摇匀后再加入ɑ-萘胺试剂2mL，再次混合摇匀，静置30min，用分光光度计（520nm）进行测定，记下OD值，从标准曲线上读出NO₂^- 含量，再计算酶活力，以每小时每克鲜重产生的NO₂^- （g或mol)表示。

3.标准曲线的制作

测定NO₂^- 的磺胺比色法很灵敏，可检出低于1g/mL的NaNO₂ 含量，可于0-5g/mL范围内绘制标准曲线。由于显色反应的速度与重氮反应及偶联作用有关，温度、pH都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速

度相同，彼此可以比较。

吸取不同质量浓度的NaNO₂ 溶液（0.5、1、2、4、5g/mL）1mL于试管中，加入磺胺试剂2mL及ɑ-萘胺试剂2mL，混合摇匀，静置30min（或于一定温度水浴保温30min），立即于分光光度计（520nm）比色。以OD值为纵坐标，NaNO₂质量浓度为横坐标，绘制OD-质量浓度曲线。

六、丙二醛的测定

1. MDA的提取 盆栽小麦在抽穗期停止浇水，进行干旱处理，取叶片1g将其剪碎，加入10%三氯乙酸（TCA）2ml和少量石英砂，研磨；进一步加入8mlTCA充分研磨，匀浆液以4000g离心10min，上清液即为样品提取液。

2. 显色反应及测定 吸取2ml提取液，加入2ml0.6%TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中煮15min，迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm处的OD值。对照管以2ml水代替提取液。

3. 计算 MDA与TBA反应产物的最大吸收峰在532nm，TBA与可溶性糖（以蔗糖为例）的反应产物的最大吸收峰在450nm，吸收曲线彼此又有重叠。

七、质膜透性

1.清洗用具

所用玻璃用具均需先用洗衣粉清洗，然后用蒸馏水、去离子水洗3次，干燥后备用。

2.实验材料的准备及处理

选取叶龄相似的植物叶片(苏香梗3号)，剪下后用湿布包住。实验时用自来水将供试叶片冲洗，除去表面沾污物，再用蒸馏水冲洗1～2次，再用去离子水清洗1-2次，用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分，然后剪成约1cm的小叶片（或用直径为1的打孔器钻取小园片），注意除掉大叶脉。将剪下的小叶片混合均匀，快速称取鲜样三份，每份1g，分别放入编号为A、B、C的三个烧杯中。作如下处理：

A杯放入冰箱0℃以下作低温处理，处理15～30min后取出（供试叶片也可以在实验前低温处理好待用，处理温度及时间依不同植物叶片耐寒性而定），加入去离子水50ml。 B杯常温处理，加入去离子水50ml。

将A、B二杯放入真空干燥器，用真空泵抽气2030min（以抽出细胞间隙中的空气），然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出A、B杯。

C杯加入蒸去离子水50ml，称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸10～15min（煮沸时间

依不同植物叶片而定），冷却后再称重并加去离子水至原重量，继续浸泡叶片。

将A、B、C三杯放置室温下浸提1 h左右（经常摇动，以有利电解质外渗）。然后将叶片从杯中夹出进行下一步测定。

3.电导率测定

用电导仪分别测定A、B、C三杯的电导率，同时测定去离子水（空白）的电导率（注意：每测定完一个样液后，用去离子水漂洗电极，再用滤纸将电极擦干，然后进行下一个样液的测定），所测得的结果记入下表：

处理	电导率（μScmˉ１）	电解质的相对外渗率
去离子水（空白）
A（低温）
B（常温）
C（煮沸）

结果计算：

按下列公式计算低温及常温处理的电解质的相对外渗率：

处理电导率空白电导率

电解质的相对外渗率（%）= 100%

煮沸电导率空白电导率

八．叶绿素含量

用叶绿素测定仪测定。

4. 参考文献

[1]张美萍,陕永杰,江玉珍，等.稀土微肥对盐胁迫下黄豆幼苗抗氧化酶的影响[j].稀土,2009，30（3）：53-56.

[2]唐加红，杨玉兰，苑中原，等. 镧对干旱胁迫下小麦幼苗抗氧化系统的影响[j].稀土，2011，32（1）：12-16.

[3]邱琳，周青.镧对酸雨胁迫下水稻种子cat的影响[j].环境化学.2009,28(4):535-538.

[4]吴遥琪，彭莹，唐璐，邱琳，周青.酸雨胁迫下la（Ⅲ）对水稻种子萌发及pod活性影响[j].农业环境科学学报.2008,27（5）:1901-1906.

5. 计划与进度安排

1、2022年12月6日-2022年1月10日 按照指导教师要求，查阅相关文献；

2、2022年2月16日-2022日2月28日 与指导老师见面 ，汇报所查阅文章概况；接受任务；

3、2022年3月1日-2022日3月21日 根据任务书撰写开题报告；进行预实验，熟悉相关实验方法；以上工作在课余完成。