盐胁迫下水稻两个突变体及其野生亲本在营养期的生理和蛋白质组反应外文翻译资料

盐胁迫下水稻两个突变体及其野生亲本在营养期的生理和蛋白质组反应

作者单位：

a Department of Molecular Physiology, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Karaj, Iran

b Department of Systems Biology, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Karaj, Iran

c Department of Molecular Systems Biology at Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran.

摘要

盐度是全世界范围内影响水稻生长和生产力的主要环境限制因子之一。水稻是对盐分最敏感的作物之一，尤其是在生长早期。为了更好地了解水稻耐盐突变体的分子途径，我们利用基于2-DE的蛋白质组学来探索与盐胁迫响应相关的蛋白质组学变化。生理结果表明，盐胁迫条件下，突变体的标准评价体系(SES)评分、茎中Na 、K 浓度及Na /K 比值均存在显著差异。蛋白质组学分析表明，在重复检测的854个蛋白点中，有67个蛋白点对盐胁迫有显著反应。串联质谱分析这些显著差异积累的蛋白质，鉴定出34个独特的蛋白质。这些蛋白质参与各种分子过程，包括防御氧化应激、代谢、光合作用、蛋白质合成过程和信号转导。其中一些被鉴定的蛋白是盐胁迫耐受的关键参与者。讨论了盐反应蛋白在植物适应盐胁迫中的可能意义。

关键词：水稻；突变；盐胁迫；蛋白质组；双向凝胶电泳；质谱分析法

引言

盐是全球作物生产的主要环境制约因素之一。据估计，全世界有超过8亿公顷的土地受到高盐的影响。高盐导致水分缺乏、离子毒性和营养缺乏，导致分子损伤、生长停滞，最终细胞死亡。盐胁迫加速了对植物细胞有害的活性氧(ROS)的过量产生。为了应对盐害，植物已演化出一种调节其在不同器官中的积累和分配的机制来。植物可以在其根部排除Na 和Cl ^-，但这种排除程度在盐生植物和糖生植物中有所不同。此外，许多植物已经进化出积累相容溶质的策略，这对植物适应渗透胁迫具有重要作用。胞质中渗透物质的积累在盐生植物和糖生植物保护细胞质免受盐分危害中发挥重要作用。

水稻一般属于盐敏感作物，但不同生长阶段对盐敏感程度不同。一般认为水稻在萌发和活跃的分蘖阶段对盐胁迫具有耐受性，而在营养生长早期和生殖阶段表现出较强的敏感性。水稻常作为最适合盐害土壤的作物，因为它可以在淹水条件下生长良好，有助于滤除有害的盐。

诱变技术已被广泛应用于植物育种中，以产生遗传多样性。化学诱变被认为是传统遗传学的主力。诱变能高效地产生变异，近年来已广泛应用于基因发现和作物新性状的开发。在过去的78年里，诱变育种对植物特性进行了大量有价值的改变，从而提高了特定作物的产量潜力和质量性状。到20世纪末，这些努力已经产生了超过434个突变水稻品种。这清楚地表明了这种强有力的技术在植物育种中的重要性。早熟、矮小、非生物胁迫、抗病虫害是诱变育种最重要的目标性状。与传统方法相比，诱变育种可以大大缩短培育新品种的时间，传统方法需要通过一系列回交将特定基因从其他遗传背景中融合进来。在大豆、大麦、烟草、蕨类植物和拟南芥中已经报道了几个具有耐盐性的单基因突变。显然，通过常规育种已经为提高水稻耐盐性做出了相当大的努力，但进展缓慢。诱变和传统育种方法的结合可能为开发耐盐水稻品种开辟新的前沿。近年来，一些研究成功地鉴定出耐盐突变体。耐盐育种项目的一个关键挑战是识别出耐盐基因，并有效地利用识别出的基因来加速作物育种。

比较蛋白质组学分析可以为鉴定在盐胁迫耐受中起关键作用的基因提供联系。作为水稻功能基因组学项目的一部分，国际水稻研究所(IRRI)从籼稻品种IR64中培育了大量突变体。该品种在亚洲广泛种植，因为它具有良好的农艺性状和抗多种病虫害。其中一些细胞系已被评估为各种生物和非生物胁迫，以鉴定具有前景性状的突变体。例如，通过正向遗传学分析，很少发现对稻瘟病、细菌性白叶枯病和通格罗病毒抗性增强或丧失的突变体。

基于二维电泳的蛋白质组学方法已被广泛用于研究植物的盐诱导反应。在先前的研究中，应用蛋白质组学方法研究水稻幼苗期对盐胁迫的响应。本研究以IR64为亲本和两个对盐胁迫敏感性不同的IR64突变体为研究对象，通过比较蛋白质组学分析来鉴定盐胁迫下的差异表达蛋白。据我们所知，这是第一个利用蛋白质组学来发现野生型亲本及其突变系在营养期对盐度做出反应时蛋白表达谱变化的报告。

材料和方法

材料准备

两个IR64突变株系，一个(167-1-3)耐盐性较好，另一个(S-730-1)对盐胁迫敏感，以及野生型亲本(IR64)用于在3次重复的小区实验中评价抗盐性。2006年9月至10月，在国际水稻研究所(IRRI)进行水培条件下生长实验，试验中，培养室(温室)昼/夜温度和相对湿度设置在29/21℃和70-75%。

简要地说，种子在50^◦C温度下在电烘箱中热处理5天以打破种子休眠，然后浸泡在50%的次氯酸盐溶液(商业漂白剂)中，用蒸馏水彻底冲洗。随后在25℃曝气蒸馏水浸泡24小时，转移到在底部有两层沃特曼5号滤纸的培养皿中，在恒温箱中32^◦C培养48h。每个洞播种两颗预先发芽的种子，在泡沫塑料苗浮子上播种，底部的网悬浮在装有蒸馏水的12升塑料托盘上，持续3天。每个入口被播种在两排(20个孔)的苗浮上。每个重复包含10个托盘。第4天，将蒸馏水换成吉田营养液，在营养液上种植10天。每5 - 7天更新一次溶液，pH维持在5.0 / d(加1 NNaOH或HCl)。在胁迫之前，将弱苗或非型苗移走，以确保试验开始时的均匀性。播种后13 d，在营养液中加入NaCl进行盐胁迫。营养液的电导率(EC)在5天内每隔2天按3步(6、8和12ds mminus;1)逐渐增加，直到最终达到12ds mminus;1，相当于120 mM。在试验过程中，利用德国WTW 340手持式EC仪监测胁迫处理营养液的EC值，并维持在12ds mminus;1。使用吉田溶液的非盐处理的对照的EC为0.94-1.1 dS mminus;1。根据研究描述的表型症状，使用改良的水稻标准评价系统(SES)分别在盐渍化后10和16 d进行评分。通过测定突变体盐吸收来阐明在营养生长阶段早期的耐盐性和敏感性的生理生化基础。

标准评价体系(SES)和存活率

如Gregorio, 1997年所述，水稻的改良SES被用于评价盐损伤的视觉症状。当敏感突变体得分为7时进行最终评分和抽样。在最终评分时，统计每一品系的成活株数和成活株的百分比。在其余的测量中，每个基因型的5个植株在收获时被取样，并被分为根和芽。根茎样品用蒸馏水彻底清洗，以去除表面的盐分。样品被吸干，然后对所有的样品进行测量。所有数据都是每次复制5株植物的平均值。

株高、根长和干重

用一米棒在幼苗样本上测量植株的株高(cm)，从茎的基部到植株最高或最幼完全展开的叶片的顶端。还测量了每种植物的根长，并计算其平均值。根和茎样品在75◦温度下烤箱烘干72h，测定其各自的干重。

植物组织中钠、钾和离子吸收的测定

为了测定根和枝对钠、钾离子的吸收总量，测定了根和枝对钠、钾离子的浓度和钠钾比(Na /K )。对于每个复制中的每个基因型，五株植物被连根拔起并如前所述彻底清洗，以去除组织表面的盐。根和芽是分开和干燥的烤箱在75◦C 72小时。根和芽的样品被研磨成细粉，10mg干燥的研磨材料被转移到15ml的Pyrex试管中。组织提取是加入10毫升0.1 N乙酸的样品和煮沸在90◦C至少水浴2小时。提取的组织在室温下冷却，用0.1 N的乙酸替代蒸发的溶液。提取液存放一夜，加入1ml提取液，加入9ml dH2O稀释10倍。用原子吸收分光光度计(AAS3100,PerkinElmer,USA)测定稀释样品中的Na 和K 含量。

蛋白质组学分析取样

根据表型数据，选择盐胁迫6d的幼苗进行蛋白质组学分析。三种基因型均在到达后采集拍摄样品。最终EC为12ds m^-1。每个基因型共收获3株植物，构成单个生物复制。将幼苗从网中拉出，分根、分苗、分苗池，用铝箔包好，贴标签，液氮速冻，80℃保存分析。

蛋白质的提取

对2个突变系及其野生型亲本采集的3个独立重复的叶片样本进行了蛋白质组型分析。叶样品（1g）与液态氮混合，利用研钵和研棒将其磨碎成粉末，由此产生的粉末放入在寒冷的伴随有0.07%（w/v）二硫苏糖醇的10%（w/v）三氯乙酸丙酮并且在20℃下保温1h，紧随其后的是离心35000xg 15分钟。用含有0.07%DTI在-20℃的冰冷丙酮清洗3次，持续一小时，最后在4℃、17000rpm离心收集样品，然后冻干，在裂解缓冲液（8M尿素，2M硫脲，2%（w/v）CHAPS，0.8%（w/v）Pharmalyte PH 3-10，1%（w/v）DTT）中溶解，可溶性蛋白可通过12000xg离心15分钟回收。蛋白浓度由Bradford assay(Bio-rad)测定，以BSA为标准。

蛋白质的提取

对2个突变系及其野生型亲本采集的3个独立重复的叶片样本进行了蛋白质组型分析。叶样品（1g）与液态氮混合，利用研钵和研棒将其磨碎成粉末，由此产生的粉末放入在寒冷的伴随有0.07%（w/v）二硫苏糖醇的10%（w/v）三氯乙酸丙酮并且在20℃下保温1h，紧随其后的是离心35000xg 15分钟。用含有0.07%DTI在-20℃的冰冷丙酮清洗3次，持续一小时，最后在4℃、17000rpm离心收集样品，然后冻干，在裂解缓冲液（8M尿素，2M硫脲，2%（w/v）CHAPS，0.8%（w/v）Pharmalyte PH 3-10，1%（w/v）DTT）中溶解，可溶性蛋白可通过12000xg离心15分钟回收。蛋白浓度由Bradford assay(Bio-rad)测定，以BSA为标准。

二维凝胶电泳

等电聚焦(IEF)和二维SDS-PAGE如前所述。简单地说，24cm固定pH梯度(IPG)条(pH4-7,Bio-Rad)在室温下用450ul的再水化缓冲液(8M尿素，2M硫脲，0.5%CHAPS,20mMDTT,2%(v/v)IPG缓冲液)在再膨胀托盘(GEHealthcare)中再水化一夜。分别加入250ug和1.5mg蛋白用于分析和制备凝胶。在20℃下使用Multiphor II和干燥试剂盒(GE Healthcare)下进行IEF。运行条件设置为:300V-30min,500V-1h,2000V-3h，和3500V为总70千瓦时。聚焦条带在含1%DTT和/或2.5%碘乙酰胺的10ml平衡溶液中平衡两次，每次15min。使用一个千变万化的十二烷基细胞(BioRad)在11%的丙烯酰胺凝胶垂直板上进行二维实验。分析凝胶和制备凝胶中的蛋白斑点分别用硝酸银和CBB G-250胶体显像。

染色和图像分析

凝胶图像使用GS800校准密度计(Bio-Rad)获取，分辨率为每平方英寸600点(dpi)。如前所述，使用Melanie 4软件(GeneBio,Geneva,Switzerland)分析凝胶图像。用标准蛋白标记共电泳法(GE Heathcare)估计凝胶上蛋白的相对分子质量，用24cmIPG条带上蛋白点的相对迁移法(pH 4-7)估计蛋白的pl。从3种重复凝胶中测定每个斑点的体积百分比(%vol)，并作为定量值。结合2个突变系及其野生型亲本和2个处理(对照和盐处理)，采用单因素方差分析(one-way variance, ANOVA)进行基因型times;处理组合分析。采用MSTAT-C软件(EastLansing,MI)进行方差分析，均数比较采用Duncan s多量程检验，plt;0.05。当plt;0.05时，斑点显著增加或减少，且丰度的倍数变化大于2。

蛋白质鉴定和数据库检索

从制备CBB染色凝胶中剪下感兴趣的蛋白点，在室温下使用100%氰化甲烷/50mM生物碳酸铵(NH₄CHO₃)(50:50v/v)的新鲜配制的洗涤液分离1小时。洗溶液被移除和斑点留在30分钟在37◦C干燥。用含有12ng/l(10l)胰蛋白酶的50mM碳酸氢盐溶液消化蛋白。此反应在4◦C下继续进行45分钟。除去多余的胰蛋白酶溶液，加入20ul 50mM碳酸氢铵，然后将凝胶片放置在37◦C培养箱过夜。每个馏分的1ul直接应用于磨碎的钢MALDI靶板，通过加入等体积的新鲜制备的5mg/ml 4-羟基- r -氰基肉桂酸(Sigma)溶液，50%水溶液(v:v)含0.1%，三氟乙酸(v:v)。利用配备了Nd:YAG智能光束激光器的串联飞行时间质谱仪（Bruker ultraflex ）II

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