冻干单克隆抗体制剂在跌落过程中的蛋白亚可见颗粒和自由基形成

原文作者 Wei-Jie Fang^1,2*, Jia-Wei Liu^1,2, Hong-Jian Zheng^1,2, Bin-Bin Shen^1,2, Xinyu Wang³, Yi Kong⁴, Zhen-Yi Jing^1,2, Jian-Qing Gao⁵

单位 1 浙江大学药学院药物代谢与药物分析研究所，杭州 310058

2 浙江大学杭州创新医学研究院，杭州 310016

3 浙江大学化学系，杭州 310013

4 杭州萧山区第一人民医院，杭州 311200

5 浙江大学药学院药剂学研究所，杭州 310058

摘要：长期以来，人们都知道液体生物制剂在运输和处理过程中跌落会导致蛋白质降解和聚集。另一方面，冻干蛋白质制剂的意外跌落通常不被认为是生物制药质量的主要问题。在冷冻干燥蛋白质制剂的运输和处理过程中稳定性，尤其是潜在降解机理的报告很少见于文献中。在这份手稿中，我们报告了一个有趣的现象，即反复跌落冷冻干燥的单克隆抗体X（mAb-X）制剂粉末会导致重组液体中出现显著的蛋白质亚可见颗粒（SbVP），通过灵敏的颗粒分析仪器微流成像分析仪（MFI）测得。通过电子顺磁共振（EPR）观察到反复跌落后有自由基形成。自由基清除剂甲硫氨酸和3-甲氨酰基-2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧（CTPO）可部分抑制SbVP的形成。自由基和SbVP的数量与样品跌落过程中的温度相关。因此我们认为跌落过程中形成的高温可能是蛋白质聚集和自由基形成的根本原因，这可能进一步导致蛋白质聚集。我们的观察表明，与液体蛋白质制剂一样，冻干蛋白质制剂也应避免或减少跌落。

关键词：聚集；跌落；电子顺磁共振；自由基；重力；微流成像；蛋白亚可见颗粒

1引言

在过去的几十年中，基于蛋白质的生物药作为挽救生命的疗法变得越来越重要。然而，生物药物通常稳定性较差，并且在制造、储存、运输和处理过程中容易降解^1,2。生物药降解，尤其是聚集和颗粒形成（SbVP），一些研究人员已经推测为导致免疫原性的潜在风险因素^3-6。因此，美国食品药品监督管理局(FDA)强调申请者应采用风险缓解方法，包括定量测量这些颗粒、了解形成机制以及制定有效的控制策略⁴。在过去十年中，颗粒分析技术在表征蛋白质聚集方面变得越来越流行^7-12。

运输和处理过程中的生物药物降解已被认为是一个严重的问题，可能会危及产品的安全性和有效性，特别是因为一旦生产商制成和运输蛋白质产品，这些环境敏感蛋白质产品的结构完整性和质量不容易被监视和控制^13,14。最近，液体生物制剂在运输和处理过程中跌落的影响越来越受到关注。伦道夫等人在科罗拉多大学，首先彻底研究了跌落对溶液中的两种单克隆抗体和重组人生长激素的影响¹⁵。通过对装有这些产品的玻璃小瓶施加受控的重力，观察到蛋白聚集和颗粒形成。由于回声冲击波，气泡会在毫秒的时间过程中周期性地坍塌并重新出现，这会产生羟基自由基并导致蛋白质聚集和甲硫氨酸和/或缬氨酸残基的氧化¹⁵。在另一份报告中，跌落冲击增加了预装注射器中的硅油颗粒和蛋白质SbVP¹⁰。虽然聚山梨醇酯阻止了蛋白质颗粒的形成，但聚山梨醇酯的存在显着增加了跌落过程中硅油颗粒的形成。空化是由机械力（例如泵送或跌落）引起的液体中气泡的快速形成和破裂^15-17。尽管空化现象已多次在液体制剂中被描述，但在固体，尤其是软固体中也被报道了类似的过程^18-20。

另一方面，蛋白质冻干制剂的生产后期过程通常不被认为是质量的主要问题，因为在这些条件下，冷冻干燥被预期可以最大限度地减少蛋白质的不稳定性，即预期储存温度的偏差和暴露于机械应力，例如搅拌，这对于液体制剂更受关注。因此，对于该领域来说，普通运输和处理一般不会导致冻干蛋白质制剂降解，这是该领域的常识。运输和处理对生物制剂冻干粉质量和结构的影响很少被报道或深入研究。事实上，关于冻干蛋白制剂在处理和运输过程中降解的文献很少。Telikepalli等人对加速运输类应力(即暴露于振荡应力)后的冻干IgG1单抗的物理稳定性和SbVP形成进行了表征²¹。到目前为止，还没有关于在跌落过程中（即通过重力冲击）冻干生物药品降解的报告。

我们观察到经微流成像(MFI)分析后，反复跌落的冻干mAb-X制剂的质量时形成了大量SbVP。在这份手稿中，我们描述并提出了根本原因和补充机制，即在跌落过程中产生热量和自由基，分别用于在跌落过程中冻干蛋白质降解。我们还建议，和液体制剂一样，冻干蛋白制剂也应尽可能避免或减少跌落，并应充分评估制剂组成对颗粒形成的影响。

2材料和方法

2.1材料

冻干mAb-X制剂（含150 mg蛋白质、136.4 mg海藻糖二水合物、3.7 mg组氨酸、2.2 mg组氨酸盐酸盐一水合物和0.6 mg聚山梨醇酯20，最初在冻干前溶解在6 mL溶液中），蛋白合成使用稳定的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系由浙江海正药业有限公司（中国浙江）制造。mAb-X是一种人源化IgG1 kappa单克隆抗体，分子量约为148 kDa。TSK G3000SWxl凝胶过滤柱、Propac WCX-10色谱柱和Ultimate XB-C4反相色谱柱分别购自TOSOH（日本东京）、Thermo Fischer（美国加利福尼亚州桑尼维尔）和Welch Materials（中国上海）。CE-SDS检验设备购自Beckman Coulter(亚特兰大，美国)。辅料级组氨酸盐酸盐、组氨酸、聚山梨醇酯20和蛋氨酸(Met)购自JT Baker(雷诺德,美国)。海藻糖二水合物购自Pfanstiehl(沃基根,美国)。3-甲氨酰基-2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧（CTPO）购自Alfa Aesar（中国上海）。5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）购自Energy Chemical（中国上海）。灰色丁基塞（13 mm）购自West Pharmaceuticals（新加坡，新加坡），而I型硼硅酸盐闪烁瓶（2 ml）购自Schott（中国苏州）。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和氯化钠购自国药化学试剂（中国上海）。0.22 mu;m聚醚砜膜和0.45 mu;m尼龙膜过滤器购自Millipore (比勒利卡，美国)。

2.2样品制备和冷冻干燥

通过溶解制备含有25 mg/mL mAb-X、20 mM组氨酸盐酸盐缓冲液、60 mM海藻糖、0.01%(w/v)聚山梨醇酯20、pH 6.0、有或没有20 mM Met或CTPO作为自由基清除剂的制剂冻干mAb-X制剂粉末(150 mg mAb-X)与6 mL蒸馏水、20 mM Met或CTPO溶液。分别制备相应的缓冲液制剂（不含mAb-X）。通过0.22 mu;m 微孔聚醚砜膜过滤后，移取1 mL制剂溶液至2 mL闪烁瓶（内径 13 mm）中，并在VirTis AdVantage冷冻干燥机（加利福尼亚州洛杉矶，美国）中使用与前面描述的相同的冷冻干燥循环²²。冷冻干燥后，经卡尔费休库仑计测得的水分含量小于1%，所有样品均呈现出优雅的蛋糕体，没有明显的塌陷或回熔。

2.3冻干粉跌落和固体重构

将冷冻干燥的mAb-X制剂粉末都在2 mL闪烁瓶中置于室温下从1.5 m处自由跌落50次，除在上下文中特别提及跌落时间或使用的温度。对于在高温(70 °C)或低温(4 °C)下跌落的样品，它们首先在相应温度下平衡20分钟。在未跌落的情况下，将冻干粉在70 °C下孵育20分钟不会显着影响稳定性（见下文）。跌落的和未跌落的对照样品用蒸馏水复溶，形成25 mg/mL的蛋白质溶液，用于目视检查、体积排阻高效液相色谱(SE-HPLC)、MFI和紫外-可见光谱分析，或0.2和12.5 mg/mL分别用于远紫外和近紫外圆二色性（Far- and Near-UV CD）分析，而跌落的粉末立即通过电子顺磁共振(EPR)进行评估，无需重构。为了确认在更恶劣的条件下跌落是否会导致蛋白质化学和物理降解反应，例如断裂和共价聚集，将mAb-X制剂粉末（不含Met或CTPO）在70 °C下跌落200次，并通过目视检查、紫外-可见光谱、SE-HPLC、CD、十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)、反相(RP)和离子交换(IE) HPLC。

2.4微流成像分析仪(MFI)

如前所述，通过MFI 5100 系统（Protein Simple，圣克拉拉，加利福尼亚州）表征跌落和对照蛋白质溶液的蛋白质SbVP（ge;2 mu;m）²²。计算每个样品的每毫升2–5 mu;m、5–10 mu;m、10–25 mu;m 和 25–300 mu;m 颗粒的平均（至少重复三次）累积数量。

2.5体积排阻高效液相色谱(SE

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