1. 研究目的与意义
课题拟通过基因工程方法，利用基因融合技术使米根霉脂肪酶基因与锚定蛋白Sedlp融合，建立毕赤酵母细胞表面展示载体，为米根霉脂肪酶在毕赤酵母细胞的表面展示奠定基础。
2. 国内外研究现状分析
最近，Tanino等将南极酵母脂肪酶B基因与Flo1融合，将两种单倍体细胞株杂交形成二倍体细胞株，获得能够在细胞表面高效稳定表达脂肪酶的工程细胞，酶活最高可达117U/g干细胞，用这种新型的全细胞催化剂催化合成聚酯的反应，反应副产物较之传统的金属离子作催化剂大大降低。Jiang等将荧光假单胞菌脂肪酶LipB52与展示载体蛋白Flo1基因融合后转化毕赤酵母KM71，构建成的毕赤酵母表面工程细胞株具有与酿酒酵母细胞株相当的脂肪酶活性，酶的热稳定性较后者有一定提高，并且毕赤酵母的发酵密度更高，每升发酵液细胞干重可达到酿酒酵母的5倍，可见在某些情况下毕赤酵母是比酿酒酵母更适合作为全细胞催化剂的宿主细胞。
刘文山等采用PCR方法扩增得到解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2成熟肽编码基因LIP2，将其连接到AGA2基因的下游构建表面展示载体pCTLIP2。展示Lip2的酿酒酵母重组菌株在半乳糖的诱导下，表现出水解橄榄油、三丁酸甘油脂以及pNPP的活性，20oC诱导72h时酶活达到最高，为182U/g干细胞。并对其酶学性质进行了研究。潘志友等从南极假丝酵母基因组克隆得到南极假丝酵母脂肪酶B全基因片段，与酿酒酵母细胞表面展示蛋白a-凝集素的C端连接融合，构建表面展示载体，转化酵母后获得在酿酒酵母细胞表面成功展示的重组酿酒酵母菌pICAS-celAL-CALB。经冻干能有效地实现在非水相中全细胞催化己酸和乙醇酯化合成己酸乙酯。反应物己酸与乙醇的摩尔比为1:1.25，己酸乙酯的产率为98.0%，具有较好的操作稳定性。
3. 研究的基本内容与计划
1）选择sed1p作为锚定蛋白，将成熟脂肪酶编码基因克隆至毕赤酵母的表达质粒ppiczaa中aox1启动子及信号序列或者脂肪酶自身信号序列下游，构建分泌表达载体；
（2）将锚定蛋白编码基因克隆至分泌表达载体中的n端以构建表面展示载体，利用橄榄油和罗丹明b平板定性检测脂肪酶活性。
研究计划：
4. 研究创新点
将米根霉脂肪酶在毕赤酵母细胞表面进行展示的研究，国内外少见报道。 |
