黑曲霉内切菊粉酶在毕赤酵母细胞表面的展示开题报告

1. 研究目的与意义

本研究克隆了来自酿酒酵母eby100的pirl蛋白成熟肽基因（pirl-a），连接入毕赤酵母分泌表达载体ppic9k中，构建了新型毕赤酵母表面展示的通用载体ppic9k-inu-pir1。

利用α-factor信号肤将蛋白引导分泌至细胞外，通过免疫荧光分析以c端与pirl蛋白融合而展示于毕赤酵母表面的内切菊粉酶，证明新的毕赤酵母表面展示系统的构建是成功的。

在此基础上，对表达产物进行酶活检测以及酶水解产物分析。

2. 国内外研究现状分析

详见文献综述

3. 研究的基本内容与计划

（1）酿酒酵母EBY100基因组的提取（2）目的基因的扩增（3）pPIC9K质粒的提取（4）pPIC9K-pirl质粒的构建（5）内切菊粉酶基因与pPIC9K-Pirl质粒的双酶切（6）重组质粒pPIC9K-pirl-Inu的构建（7）重组质粒线性化（8）毕赤酵母感受态细胞的制备（9）毕赤酵母电转化（10）毕赤酵母转化子的筛选（高拷贝筛选、PCR验证）（11）重组组毕赤酵母菌株的表达（12）免疫荧光分析（13）菊粉酶活力测定的方法

4. 研究创新点

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速，应用广泛的一种真核表达系统。

其具有易于培养、繁殖快、具有乙醇氧化酶基因诱导型强启动子，可调控外源基因的表达，可对外源蛋白进行更接近高等生物的加工折叠和翻译后修饰、便于基因工程操作和高密度发酵等的特性，成为微生物表面展示系统极有应用前景的宿主菌。