1. 研究目的与意义
巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)是一种极具潜力的酵母表达系统,与大肠杆菌相比,酵母菌除了具有细胞生长快、易于培养、遗传操作简单等原核生物的特点外,还具有真核生物对蛋白质进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能,能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足;并能对许多蛋白质产物进行分泌,使产物易于提纯。目前,高密度发酵工艺已成为生物技术中进行中试生产的主要发酵工艺,其工艺稳定,发酵周期可缩短超过50%,而菌体产量和产物表达量是非高密度发酵的10～50倍,蛋白活性提高2～3倍,本论文采用前期表达的基因工程菌进行双底物流加诱导策略研究。
巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一。Pichiapastoris具有与真核生物极其相似的分泌途径和很强的真核蛋白质修饰功能,并且其自身分泌的蛋白质很少且易于高密度发酵,因此在表达和分离纯化异源蛋白质等方具有很强的优势[6]。目前国内外对木聚糖酶在Pichiapastoris的表达方面做了大量研究,如Aspergillusnige,Streptomycesolivaceoviridis,Bacilluspumilus等来源的木聚糖酶在Pichiapastoris中已得到成功表达[7]。
2. 国内外研究现状分析
毕赤酵母表达宿主菌于80年代开发获得，大多应用宿主菌是通过对野生菌型石油酵母y11430进行突变改造而来。在组氨酸脱氢酶基因（his4）处有一突变，用于转化后筛选重组菌株。其他的一些营养缺陷宿主菌或生物合成基因也可作为筛选标记。
河南农业大学生命科学学院实验室已克隆了来自黑曲霉a225菌株的高比活力木聚糖酶基因xynⅡ(genbank登录号为eu375728),并已重组到毕赤酵母表达载体ppic9k上,该试验拟通过电击转化毕赤酵母gs115,由于基因重组整合事件的多样性将造成重组菌株的多样性,不同的整合拷贝数能产生不同的表达量,因此该试验将根据基因剂量效应,利用g418的抗性水平,筛选出木聚糖酶基因xynⅡ高拷贝整合的转化子,并对其甲醇诱导条件进行优化,为获得可用于木聚糖酶生产的毕赤酵母工程菌株奠定基础。
毕赤酵母属的细胞由短椭圆形至圆柱形，多边芽殖，多数种形成假菌丝，在子囊形成前行同型或异型接合或不接合。子囊孢子球形、帽形或土星形，其凸起用普通光学显微镜容易看到。孢子中常有1个油滴，表面光滑，有的孢子壁外层具痣点。每囊含1~4个孢子，子囊常易破裂而释放出孢子。毕赤酵母属的酵母菌对于正癸烷、十六烷的氧化能力较强，日本曾用石油和农副产品或工业废料培养毕赤酵母来生产蛋白质。毕赤酵母常是酒类饮料的污染菌，在酒的表面生成白色干燥的菌醭。麦芽汁中也容易形成醭。
3. 研究的基本内容与计划
研究内容
巴斯德毕赤酵母有很好的发酵基础,菌体密度可达100g/l以上的干重和400g/l以上的湿重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源,廉价而无毒。它能在以甲醇为惟一碳源的培养基中生长,其中醇氧化酶aox可达细胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到aox。aox的基因启动子具有明显的调控功能,可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导双重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态,而在培养液中加入甲醇后,外源基因即被诱导表达。
目前利用基因工程毕赤酵母表达生成外源蛋白尚存在几个需解决问题。最主要的是如何最优化甲醇的流加。很明显，诱导型毕赤酵母表达目的蛋白的水平高低关键在于甲醇的流加方式。目前报道的甲醇流加方式一般是凭经验得出的，采用分阶段流加。但各个不同时期菌体由于生理状态及细胞量的不同对甲醇有不同的需求量，特别是在目的蛋白生产表达阶段，由于菌体量也在逐渐增加，对甲醇利用响应增多，若按照传统方式仍以恒定速度流加甲醇，很显然不是处于最优状态。而且，宿主细胞所表达的外源蛋白的种类和基因拷贝数的多少会影响细胞的生理活性和底物代谢能力。表达不同蛋白的毕赤酵母消耗甲醇的速率也不一样，文献报道的最优流加方式对某一具体的蛋白不一定合适。若甲醇流加过快，发酵液中甲醇浓度超过0.5%，会抑制细胞生长并伤害细胞。
4. 研究创新点
采用前期表达的基因工程菌进行双底物流加诱导策略研究。
