水蜜桃贮藏过程中乙烯利处理对N-链寡糖的影响开题报告

全文总字数：2986字

1. 研究目的与意义

由于桃的生理特性，成熟后迅速软化，容易造成机械损伤，增加了水蜜桃的贮藏和运输的难度^[1]。而在以往的研究中发现n-链寡糖可能对果实成熟软化起着关键作用。n-链寡糖是桃果实中糖类物质的重要组成部分，在果实成熟软化过程中起到着关键作用，n-链寡糖的生成与消耗都与果实贮藏密切相关。本文将从乙烯利处理后果实生理活动与果实中n-链寡糖的联系进行试实验。

2.国内外研究概况

n-糖变化与桃子果实生理参数变化是相互的，确定了n-糖对桃果实的贮藏状态的影响后便能够对其作用方式及效果进行更深一步的研究。n-糖的研究大部分集中于动物体上，对于植物体n-糖的研究较少，因为植物n-糖的研究方式与动物n-糖研究方式有较大的的区别^[2]，所以能够对比的实验相对较少。尽管有部分果实发育与n-糖关系的研究，但其大多集中于果实发育的初期，对于采摘后的储藏过程研究较少。例如王承健等人就对银杏种子中的糖蛋白进行研究^[3]。本实验的实验目标集中于n-糖可能对桃果实软化产生的影响进行了研究。

2. 研究的基本内容和问题

本实验主要通过乙烯利促进桃果实成熟，在乙烯利处理后观察果实的硬度、乙烯释放、呼吸等生理参数与n-糖结构变化是否存在联系来推测n-糖对桃果实成熟过程中的影响。本实验采用测量各n链寡糖在液相色谱仪吸收峰峰面积的占比变化来推测n链寡糖结构的变化。

2.拟解决的关键问题

1.乙烯利处理对桃果实软化的生理参数的影响。

3. 研究的方法与方案

研究方法及实验方案

1. 乙烯利处理

称取10g乙烯利溶于2L水中，制成500mg/L乙烯利溶液。将桃子置于水中浸泡15min取出擦干，置于密闭泡沫箱中8H，取出。

2. 取样

取五个成熟度大致相同的桃子，标号，进行试验。

3. 桃果实成熟过程中生理活动相关参数的测量

取5个桃果实封闭于密封容器中，在2小时后从容器中抽取2mL气体，用气相色谱分析仪进行色谱分析，每组样本测量3次。分别取2.0mL乙烯标瓶标准曲线的各个点，以保留时间定性，将峰面积和浓度做标准曲线。应用面积外标法对果实释放乙烯的浓度进行定量。使用手持式氧气测量计，将探头直接插入密闭容器测取氧气浓度并记录，每组数据测量3次。

果实硬度的测定主要使用质构仪或手持式硬度测量仪。使用质构仪测量桃果实硬度的具体操作如下：取5个贮藏时间相同且成熟度相同的桃果实，去皮后在果实上均匀取2～4点，使用质构仪探头2cm进行穿深1cm的测试，得到压力变化曲线。持式硬度测量仪具体操作如下：取5个贮藏时间相同且成熟度相同的桃果实，去皮后测量果实四周四个点，记录硬度。

4. 桃果实N-糖检测

4.1 样品粉碎去糖

将所有的桃果实进行冻干并粉碎成粉末，取0.1g样品溶解于1.2ml的TCA中反复吹吸，进行离心后弃上清液，并重新加入1ml水继续震荡，重复直到样品PH为7.0。

4.2 PNGase H 酶纯化

将制备好的BM菌液解冻，使用超声波破碎仪破碎25min，然后使用离心机离心取上清。使用制备好的纯化柱，用流速约为10mL/10min的咪唑冲洗纯化柱15min左右，充分洗净纯化柱。用10mL/10min的纯水和NiCl₂分别冲洗纯化柱后，用纯水再次冲洗纯化柱以洗去多余的NiCl₂。用pH8.0的Washing Buffer过柱后将BM上清液上样使得标记蛋白与NiCl₂结合。再次使用Washing Buffer过柱洗去杂蛋白直至OD值小于1.0。用咪唑过柱洗下标记蛋白，用2mL离心管装样并测取OD值，取OD值大于0.5的样品低温保存作为下一步操作的原料。纯化完成后用咪唑以及纯水清洗纯化柱。纯化过程中酶应该置于冰块之上保持低温，防止失活。

4.3 活性碳柱处理

向去糖完成的样品中加入纯化完成的BM，将其放置于烘箱中过夜。将用BM处理完的样本进行离心并取上清液。取碳柱分别用250ml80%乙腈和250mL的纯水反复冲洗3次洗净碳柱，随后将前一步获得的上清液上样，再用250mL纯水冲洗碳柱一次，接下来先后用1.5ml20%乙腈以及1.5ml40%乙腈冲洗碳柱并用离心管收集并旋干过夜，最后用清水和80%乙腈进行清洗。将旋干得的样品用纯水复溶合并并再次旋干4小时。

4.4 2-AB标记

将获得的样品加入10μl2-AB标记液在65℃金属浴条件下4小时，获得2-AB标记的样品，贮存于-4℃冰箱。

4.5 液相检测

将2-AB标记的样品加入乙腈构成70%乙腈体系，将样品离心后加入进样瓶中，进样体积应大于样品检测体积，进行液相色谱检测。将12分钟后的各个峰相对于总峰面积的百分比的趋势变化进行趋势分析。

可行性分析

技术支撑：本实验室中对瓜果TCA去糖技术、N-糖酰胺酶进行糖链释放、荧光标记和高效液相色谱技术测定N-糖变化有过长时间研究。同时掌握气相色谱仪和硬度测量仪的使用方法。

仪器支撑：实验室中有冻干机，气相仪，液相仪等，仪器充足。

4. 研究创新点

1.国内外对桃果实中n-糖的研究较少，对n-糖在果实成熟中起到的作用的研究较少。

2.本实验使用pngase h 相对于pngase f 对植物有更好的效果。

3.本实验采用活性碳柱，分离效果更好。

5. 研究计划与进展

研究计划

1.2018年7月4日-7月16日 桃果实呼吸，乙烯释放量及硬度测量，果实取样低温保存。

2.2018年7月16日-11月20日 样品冻干及粉碎。