山樱花高山植株的芽诱导和体胚的发生研究开题报告

1. 研究目的与意义

山樱花（Cerasus serrulata）属亚热带至温带蔷薇科、樱属植物，是落叶小乔木或中乔木，花叶同放。单叶互生，长椭圆或卵状椭圆形。山樱花开花时极具观赏价值。高海拔地区的山樱花自然矮化成灌木状的高山植株，观赏价值高，资源珍贵，具有很好的开发价值。山樱花的高山植株资源比较珍贵，推广应用价值较高，但目前野生植株较多切存在较大的人为破坏。本实验对山樱花高山植株的丛芽诱导和体细胞胚胎发生两方面进行研究，探索外植体、基本培养基、激素种类及浓度配比等对愈伤组织的生长状况的不同的促进作用，以确定最佳且最快速的组培体系，提高大量植株的培育能力，对山樱花高山植株的资源有效利用提供理论前提。

2. 国内外研究现状分析

上世纪90年代开始，我国就已经开展关于植物体细胞胚胎发生的研究。研究对象以经济植物和粮食作物为主。中国科学院遗传所于1988年将华北云杉的未成熟胚产生的愈伤组织诱导出体细胞胚，并培育成小苗。其后黑龙江农业大学(1993)和四川农业大学王米力等(1996)又分别对黑穗醋栗未受精胚珠和尾叶桉种子下胚轴成功诱导出体胚并获得了再生植株。其他的还有中科院植物所、中科院上海植生所、南京林业大学等都在体胚发生和植株再生技术研究方面取得了显著的成果。最早的体细胞胚发生研究是在20世纪50年代末，Steward等发现胡萝卜根细胞离体培养产生的体细胞胚可以形成再生植株，这证明了Haberlandt提出的植物细胞全能性概念是正确的。到本世纪初，研究对象仍以木本植物、经济作物、观赏性花卉为主。美国用育种项目在实验室中用挑选处的良种作为亲本进行杂交，用杂交获得的材料进行体胚发生培养，繁殖出体细胞胚幼苗后再试验筛选良性变异，这样能使植被良种特征更显著，更有经济效益。木本植物的组织培养技术是20世纪初以植物生理学为基础的一门新兴技术，樱花组织培养工作开展较晚。组织培养可以为樱花的快速繁殖提供有效途径，目前较为成功的途径是对外植体如嫩梢、侧芽、幼叶进行诱导，促进愈伤组织的生长，最后对其进行生根培养。生长季节进行组培易成功，但是不同种或品种有其各自的最佳培养时期。器官培养和快速繁殖是组织培养的重要内容。以茎尖、茎段等作为外植体，通过组培技术进行离体快速繁殖，在较短时间内产生大量遗传上一直的植株，这些个体组成无性系。在器官发生中经常不经愈伤组织阶段而直接将其培养成苗。在丛芽诱导方面的研究：黄宇翔等从一年生实生苗上摘取抽至4cm左右的嫩枝，在自来水下冲洗半小时，去除叶片，留下带叶原基和芽心的嫩枝，先用70%的酒精浸泡30s，无菌水冲洗2遍，在0.1%升汞中消毒7min，其间要不间断摇荡瓶子，以确保外植体得到全面彻底的消毒，然后用无菌水冲洗5遍以上。在解剖镜下，将枝条顶端剥开，露出生长点，切取约0.2mm，迅速接种到己打开瓶盖的诱导培养基上;剩下的茎段，切去尾部0.5cm，接种到诱导培养基上。结果发现接种于MS培养基的外植体褐化现象严重，丛生芽诱导率低于48.57%;而接种于1/4MS培养基上的外植体生长良好，褐化现象基本不发生，丛生芽诱导率达68.6%。4个诱导培养基中，以培养基1/4MS BA1.0mg/L IBA0.01mg/L效果最好，褐化率最小为31.4%，诱导率达68.6%。贾丽娜等根据相关文献选择当年生的茎段、叶片、叶柄作为实验材料，消毒接种，诱导愈伤组织及不定芽的生长。诱导培养基采用MS, B5, White, WPM培养基，设置4个处理，每个处理接种72个培养材料。实验中6-BA浓度采用0.3 mg/L, 0.5 mg/L, 1.0 mg/L共3个水平的处理;IBA浓度采用0.03 mg/L, 0.05 mg/L, 0.1 mg/L共3个水平的处理，进行双因素对比试验，综合分析二者对福建山樱花愈伤组织及不定芽诱导的影响作用。另外对NAA浓度采用0.2 mg/L, 0.6 mg/L,1.0 mg/L，共3个水平的处理，与6-BA进行双因素对比试验，并与6-BA和IBA组合进行对比试验。通过对外植体、基本培养基、激素种类及浓度配比等因素对福建山樱花不定芽诱导的影响，确定的最佳诱导培养基为:1/2MS 6-BA0. 5mg/L IBA0.01mg/L 蔗糖20g/L VC5mg/L;最佳增殖培养基为:MS 6-BA0.5mg/L IBA0.1mg/L GA0.3mg/L 蔗糖20g/L VC5mg/L;最佳生根培养基为:1/2MS NAA0.2mg/L 蔗糖20g/L VC5mg/L。黄守印等在雾灵山地区野生樱花组织培养时，在IAA含量相同情况下，减少6-BA的用量到1.0mg/l，丛生芽诱导率有所提高，芽生长增殖最快。福建山樱花在BA1.0mg/l（或KT1.0mg/l）和IBA0.01mg/l培养基上不定芽分化较好，当细胞分裂素浓度提高到BA2.0-5.0mg/l(KT2.0-5.0mg/l)时，易产生愈伤组织，芽分化较少。在体胚方面的研究：王光萍等利用春季萌发的福建山樱花嫩枝为外植体诱导丛生芽，得出结论: 在1/4MS BA1.0mg/L＋IBA0.01mg/L的培养基上，其丛生芽诱导率可达87.5％；在继代培养中选择MS BA1.0mg/L IBA0.1mg/L GA30.3mg/L或KT1.0mg/L NAA0.1mg/L GA30.5mg/L培养基，不定芽增殖较快；当芽伸长至3-4cm时切下于生根培养基1/2MS NAA1.0mg/L IBA1.0mg/L BA0.75mg/L中，可成功获得再生植株。陈金慧等选用杂交鹅掌楸未成熟合子胚，诱导培养分别以MS ,1/2MS培养基为基本培养基，附加不同浓度的2,4-D、6-BA等。接入后10d，愈伤开始启动。生成透明、色淡的愈伤组织，20d以后，将愈伤组织转移到新配置的培养基上。一次继代后，会有白色，致密的胚性细胞团出现。胚性细胞分裂速度快，增殖能力强，细胞质浓厚，从开始出现的10d内，就会长成直径约3-4厘米，鸟巢状的胚性愈伤组织。而从胚乳诱导来的非胚性细胞，其细胞质稀薄，液泡拉长，分裂速度慢，无植株再生能力，特别容易被氧化而褐变，容易与胚性细胞区别开来。在此过程中，进行细胞学观察，观察胚性细胞的形态，分裂的形式，胚性与非胚性细胞形态上的差异。实验发现亲本基因型与外植体发育状况、不同杂交组合、培养温度、培养基成分等都对杂交鹅掌楸体胚发生有影响。采样时间即幼胚发育阶段对体细胞胚胎的诱导起着至关重要的作用，球形期至子叶前期的幼胚对体胚诱导都有效。但是采样时间过早幼胚发育不好或过迟胚胎己经发育成熟，都不利于体胚的诱导；培养温度超过30℃，胚性愈伤组织将会永久失去体细胞胚胎发生能力；当培养基中2,4-D浓度为1.0 mg/L，时，诱导率低，愈伤组织生长较，一个月以后会有褐变现象产生。当2,4-D浓度为5.0 mg/L时，诱导率也较低，愈伤组织生长迅猛，到了细胞状态调整阶段以后，由于生长素的后续效应，细胞多为胞质稀薄的薄壁细胞，不利于体细胞胚胎发生。当2,4-D浓度分别为2.0-3 .0 mg/L时，胚性愈伤组织诱导频率较高，细胞生长状态容易调整，体细胞胚胎发生相对比较容易。

3. 研究的基本内容与计划

主要研究内容：1、丛芽诱导和增值；2、愈伤组织的诱导；3、愈伤组织的增值；4、愈伤组织的分化。研究计划：2013年12月-2014年01月 确定研究内容，了解相关知识。2014年01月-2014年02月 查阅相关文献资料，了解山樱花（Cerasus serrulata）及其高山植株的生物学特性，了解体细胞胚胎发生实验及其内容步骤，撰写开题报告。2014年03月-2014年04月 熟悉实验方法和实验内容，进行实验，记录数据。2014年05月-2014年06月 整理分析数据与实验结果，撰写毕业论文。

4. 研究创新点

本实验选用山樱花高山植株作为材料，取叶片、叶柄、未成熟的种等作为外植体，配置不用比例含有植物生长激素及细胞分裂素的培养基，培育观察丛芽及愈伤组织的诱导情况，分析对丛芽诱导和体细胞胚胎发生的影响因素，并通过数据分析得出较好的培养基比例，选择简单快速的组培体系，为高海拔山樱花的大量植株再生作基础。