可视化环介导等温扩增技术检测Phytophtha tentaculata的研究开题报告

全文总字数：1521字

1. 研究目的与意义

P.Tentaculata是引起土壤中越冬的卵孢子可能是次年引起作物病害很重要的侵染源，快速有效的检测手段是防止该疫霉种随带菌苗木、花草等向其他地区的迁移的一个重要手段。此外，由于疫霉菌在亲缘关系上与高等真菌相距较远，目前用于防治真菌病害的药剂无法用于防治由疫霉菌引起的病害。因此，迫切需要一种能够在植物的发病早期快速、准确鉴定出P.tentaculata引起的病害的方法，对于预测病害的发生情况和加强疫情监测，及时采取有效的防治方法控制疫病的传播和流行、减少经济损失具有重要的意义。而环介导等温扩增技术为快速分子检测提供了一条新的途径，在林木病害检测领域将会有广阔的应用前景[1]。

2. 国内外研究现状分析

传统的分离疫霉菌的方法采用诱捕法从土壤、灌溉水和植物材料中分离疫霉菌，采用选择性培养基获得病原菌的纯培养，整套过程费时费力而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。近年来随着分子生物学的发展普通pcr技术和实时荧光pcr技术已经成功用于检测疫霉菌。特别是疫霉属中致病疫霉(phytophthorainfestans)，大豆疫霉(phyto-phthorasojae)以及橡树疫霉(phytophthoraramorum)等病原菌全基因组序列的释放，极大地促进了疫霉菌的研究。利用分子生物学方法对疫霉属病原菌进行鉴定，可以有效弥补传统形态学鉴定的局限性[2]。然而pcr技术和实时荧光pcr检测虽然具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点，但是其检测时间仍然比较长，大概需要2~3h，同时pcr方法依赖精密的温度循环装置，仪器相对价格较高，不适合用于基层、欠发达国家和地区。因此建立一种快速检测木香疫霉菌的方法对于植物疫病的控制非常重要。环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，lamp）是日本的荣研株式会社发明的一种新的核酸扩增技术，因其操作简单、特异性高、成本低、快速等优点，成为可以替代普通pcr的新的核酸扩增技术。

lamp法自从2000年报道后发展迅猛，主要归功于这方法的精确、敏感及操作方法和实验条件简单的优势。基本上每出现一个传染病，人们在pcr方法检测之后就会想到用lamp法来进行检测[3]。

lamp技术依赖于能够识别靶dna上6个特定区域的4条引物和一种具有链置换作用的dna聚合酶，在恒温条件下扩增核酸，可从仅相差一个核苷酸的基因标本中找出相应靶序列进行扩增，保证了扩增的高特异性和高效率[4]。由于lamp扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在等温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。目前，国内外尚未见lamp方法检测木香疫霉菌的报道，因此本研究利用lamp方法建立了木香疫霉菌的检测技术。

3. 研究的基本内容与计划

1研究内容

本研究项目主要是以木香疫霉菌为研究对象，利用生物信息学和基因组学技术，针对木香疫霉菌的基因组进行分析，筛选出木香疫霉菌的分子检测靶标序列，利用可视化环介导等温扩增（lamp）技术，设计lamp特异性引物，建立lamp反应体系与条件，并进行灵敏度和特异性实验。

2计划安排

4. 研究创新点

本研究中筛选出木香疫霉菌的分子检测靶标序列，利用可视化环介导等温扩增（LAMP）技术，设计LAMP特异性引物，建立LAMP反应体系与条件，并进行灵敏度和特异性实验。整个检测过程仅需60-80min，即可通过肉眼直接目测实验结果；与前人相关研究结果比较异同点，指出研究不足以及待解决的问题。