1. 研究目的与意义
基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术和dna重组技术。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——dna大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的dna分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。
基因工程中表达载体的构建目的是：a.使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b. 同时使目的基因能表达和发挥作用。
质粒载体具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的dna片段(10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒dna和目的dna片段,然后体外使两者相连接,再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中,如何区分插入有外源dna的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源dna片段和载体dna的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
2. 研究内容和预期目标
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
本实验制备含有氯霉素卡抗性基因的质粒，使得当带有抗氯霉素抗性基因的载体进入芽孢杆菌en34后,在含有氯霉素的培养基中芽孢杆菌才能生长。从而根据受体细胞是否具有氯霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
3. 研究的方法与步骤
一、选择合适的载体。酶切位点及其顺序在ncbi上复制目的片段的碱基序列。使用mega比对基因序列二、氯霉素抗性基因的合成，设计引物根据前后13 个基因序列中的重复序列，设计上下游引物，核对----送公司合成。
三、重组质粒转化芽孢杆菌感受态细胞
四、重组质粒的筛选与鉴定
4. 参考文献
[1]孙文龙, 陆信曜, 宗红,等. 代谢工程改造大肠杆菌合成d-1,2,4-丁三醇[j]. 微生物学通报, 2014, 41(10):1948-1954.
[2] 贾艳华, 孙钒, 庞义, 等. 获得四环素抗性的温敏同源重组载体质粒prnt15的构建[j]. 中山大学学报(自然科学版), 2008, 47(5):81-85.
[3] 宋填, 王凤苹, 米娇, et al. 表皮葡萄球菌luxs基因敲除重组质粒的构建[j]. 成都医学院学报, 2013(1):45-48.
5. 计划与进度安排
1)2018-2019-1学期第11-19周-2018-2019-2学期第2周（2018.11.12-2019.03.10）完成翻译，设计氯霉素基因的引物与合成；
2)第3-5周（2019.03.11-2019.03.31）pgj103菌种活化与氯霉素基因的扩增；
3)第6-7周（2019.04.01-2019.04.14）pkvm1菌株活化与质粒的获取、酶切、回收；
