1. 研究目的与意义
蛋氨酸，也称甲硫氨酸，是动物生长所必需的氨基酸之一，是必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸，动物体内有80种以上的反应都需要蛋氨酸参与，被誉为“生命性氨基酸”。它可以参与体内s-腺苷甲硫氨酸（sam），硫辛酸和多胺的合成。甲硫氨酸缺乏导致一系列疾病（例如血管疾病，阿尔茨海默氏病和癌症）。
蛋氨酸分为d型和l型两种相对构型，通常来说只有l构型的氨基酸才具有生物活性，但是蛋氨酸比较特殊其d构型分子能够在体内自动转化成具有生物活性的l构型分子，也就是说d构型和l构型的蛋氨酸分子都可以被人体吸收利用，这一点对于禽畜等动物来说也是一样的。蛋氨酸无法在动物体内合成需从食物中获取，将它加入到饲料中，可以促进禽畜生长增加瘦肉量和缩短饲养周期的效果。因此，它广泛应用于制药，食品工业和饲料添加剂，2006年以来国内市场对蛋氨酸的需求量迅速增加，进口量已超过9万吨，按最新五年规划我国饲料产量将大大增加，蛋氨酸的耗量也必然增加。同时随着蛋氨酸在猪，反刍动物饲料的拓展，蛋氨酸的消费量也将出现爆发性增长。同时，随着国内经济的持续发展和人民生活水平的提高蛋氨酸在医疗保健和食品加工方面也孕育着巨大的市场潜力，年需求量也逐年增加。
迄今为止，所有商业生产的甲硫氨酸都依赖于化学合成，其中石化材料甲硫醇，丙烯醛和氰化氢用于合成dl-甲硫氨酸的外消旋混合物，而且化学合成工艺中的原料来源几乎都具有高挥发性，高毒性，对生产设备、管理要求很高。虽然动物可以代谢蛋氨酸的两种立体异构体，但当以低水平饲喂时，l-甲硫氨酸比d-蛋氨酸更容易被利用。基于天然可再生资源的低成本，环境友好型细菌生产l-甲硫氨酸与环境约束（如有毒底物，中间体和废物）和化学合成引起的高能耗相比，变得更具吸引力处理。
2. 研究内容和预期目标
本实验主要研究如何敲除metk基因，以及敲除基因后对蛋氨酸产量有无实际促进作用。通过研究甲硫氨酸通路中的反馈抑制，合成瓶颈和生长抑制后发现metk的表达受甲硫氨酸介导。通过减弱metk基因表达可以进一步改善菌株生长和甲硫氨酸生产。
芽孢杆菌中的甲硫氨酸的摄取途径和调节十分繁多。对于甲硫氨酸的复杂和严格调控的合成过程可以概括如下（总结为几个方面）：（1）天冬氨酸向碳骨架高丝氨酸的转化；（2）高丝氨酸到琥珀酰高丝氨酸的激活；（3）高半胱氨酸甲基化为甲硫氨酸。期望通过敲除metk基因以提高甲基化效率。与未敲除基因的菌株比，能够在试管与5l发酵罐中分别提高产量，希冀达到1g/l。
本实验通过敲除metk基因，分析其中甲硫氨酸通路的变化。通过实验室试管发酵，判断敲除metk基因是否能够真正改变通路以及提高蛋氨酸产量，并能够以此为依据调整发酵条件。
3. 研究的方法与步骤
实验将首先设计metk引物，根据要求，在metk基因上下游一定范围内设计上，下游扩增引物，并添加酶切位点。利用dna试剂盒提取芽孢杆菌dna，然后pcr metk基因并测序，使用大肠杆菌的基因组作为模版，由此设计引物敲除基因。最后通过用相关引物进行dna序列分析证实染色体dna中metk基因敲除，保存工程菌。
将重组菌株的一个克隆接种到含有50ml sob的250-ml锥形瓶中，并在37℃和200rpm下培养12-16小时。使用含有70ml tpm1培养基的500ml锥形瓶在31℃下在旋转振荡器中以250rpm制备烧瓶培养物48小时。将种子培养物（5％）接种到发酵培养基中进行分批发酵。
通过使用分光光度计测量600nm处的光密度（od600）来监测细胞生长。将三倍体积的10％水杨酸与发酵液样品的上清液混合，在4℃放置2小时，然后在13,000g下离心持续5分钟。取适当稀释上清液用于产品和副产物分析。氨基酸的浓度由氨基酸分析仪自动分析，洗脱曲线与标准品洗脱曲线对比，找出蛋氨酸位置并计算出相应含量。
4. 参考文献
1、孙文龙, 陆信曜, 宗红,等. 代谢工程改造大肠杆菌合成d-1,2,4-丁三醇[j]. 微生物学通报, 2014, 41(10):1948-1954.
2、曹杰. 枯草芽孢杆菌ldh基因的敲除及丙氨酸生产[d]. 安徽大学, 2013.
3、郭青云. 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体的遗传改良及plcr基因功能研究[d]. 中国科学院武汉病毒研究所, 2006.
5. 计划与进度安排
（1）第1周2022.12.01-2022.03.02利用网络资源设计metk基因的pcr引物；
（2）第2周2022.03.03-2022.03.10提取芽孢杆菌的基因组；
（3）第3周2022.03.11-2022.03.18 pcr metk基因并测序；
