1. 研究目的与意义
泛素在20世纪70年代中期被发现,随着对泛素的深入研究发现，真核细胞中也存在这一些同泛素有着部分相同序列或者蛋白，同样收探转录后的修饰作用，这类蛋白被称为类泛素家族,并且新成员不断增加。类泛素家族主要包括类泛素调节子 （ubls）和泛素区域蛋白（udps）。fat10(human leukocyte antigen f-associated transcript10)是泛素样蛋白家族的新成员，属于ubls蛋白家族是一种由165氨基酸残基组成的18kd蛋白，由两个泛素样融合而成，参与免疫炎性介导、信号转导、蛋白易位和细胞周期调控等。当用ifn-γ和tnf-α刺激细胞时,ifn-γ和tnf呈现强协同作用,诱导fat10修饰其底物,并通过蛋白酶体促使底物蛋白被快速降解。在细胞周期的前期和中期中,高表部分前后达fat10减少定位在动粒上的mad2分子,从而增加染色体的不稳定性。此外,fat10表达可以导致细胞凋亡。fat10的表达可以被p53调控,并且在肝癌细胞、胃癌细胞和妇科癌中fat10表达上调。
论文资深作者、塔夫茨大学 usda hnrca 功能基因组学项目合作科学家 martin s. obin 博士表示：“至今还没有人了解 fat10 基因的真正作用，一般认为这一基因通过炎症打开，似乎会随着妇科及胃肠道癌症的出现而表达增加。关闭 fat10 基因，能为小鼠带来多种好处，包括减少体内脂肪，减缓老化，延长至少 20% 的寿命。 ”因此，fat10的研究也为我们对一些人类的疾病的治疗和药物的开发起着很重要的作用和意义。
2. 研究内容和预期目标
本实验属于分子生物学中的基因重组内容，实验包括目标基因的获取以及目标基因的扩增和重组表达。对细胞内泛素蛋白家族的蛋白质进行基因重组然后对蛋白质在大肠杆菌中进行表达，主要通过目标基因的扩增，载体质粒的酶切以及目标基因与载体进行连接，然后转入到细胞内进行培养，然后对其进行检测，确定所插入的基因准确无误，对其进行后续操作。
因此预期目标主要包括一下几个方面：
1.查找文献，确定酵母细胞中所要研究的蛋白序列
3. 研究的方法与步骤
步骤1. 目标基因的扩增，酶切，插入及检验 pcr法可以把目的基因的寻找和扩增放在一个步骤完成。第一步、95℃高温下。使混合物的dna片段因变性而成单链。
第二步、50℃温度下，引物dna结合在适合配对的dna片段上。
第三步、72℃温度下，由合成酶催化，从引物开始合成fat10基因dna。每三个步骤为一次循环，约需3-5分钟。每经过一次循环，目的基因扩增一倍。
4. 参考文献
1.tan kl, pezzella f.inhibition ofnedd8and fat10 ligase activities through the degrading enzymenedd8ultimate buster 1: a potential anticancer approach. oncol lett. 2016 dec;12(6):4287-4296.
2.dong d, jiang w, lei j, chen l, liu x, ge j, che b, xi x, shao j.ubiquitin-like proteinfat10promotes bladder cancer progression by stabilizing surviving. oncotarget. 2016 dec 6;7(49):81463-81473.
3.xue f, zhu l, meng qw, wang l, chen xs, zhao yb, xing y, wang xy, cai l.fat10is associated with the malignancy and drug resistance of non-small-cell lung cancer. onco targets ther. 2016 jul 19;9:4397-409.
5. 计划与进度安排
本试验主要利用蛋白质重组技术将泛素蛋白fat10基因插入到氨苄青霉素抗性的质粒中，然后对蛋白质进行体外表达并纯化的过程，因此本试验的内容主要包括一下几个方面： 目标基因的扩增，酶切 ；目标基因插入到载体中 ；目标基因的表达 ；目标蛋白的纯化 。
因此根据本试验的内容，我们安排一下实验进度：
1、3月2号-3月30号 目标基因的扩增，酶切，插入及检验
