1. 研究目的与意义
天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteinase）是一类重要的蛋白水解酶,参与机体的新陈代谢及生物调控作用.它的活性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成.天冬氨酸蛋白酶包括：胃蛋白酶亚型、逆转录蛋白酶亚型、天冬氨酸膜内裂解蛋白酶亚型.天冬氨酸蛋白酶家族中的胃蛋白酶亚型需要去除前肽区域并在酸性环境的诱导下自身催化;而肾素类亚型则是由其他的酶催化.研究这些亚型的结构和活化的机制,有助于研究天冬氨酸蛋白酶家族在病理和生理情况下的变化,在某些疾病的治疗上提供了新的研究方向。
天冬氨酸蛋白酶广泛存在于病毒、真菌、哺乳动物及植物中，普遍特征是它们的活性位点cleft都包含两个催化性天冬氨酸盐残基。一般来说天冬氨酸酶的活化需要去除前肽区域，真核细胞天冬氨酸蛋白酶以带有一个n-端信号肽和一个前肽区域无活性前体形式合成，然后在内质网中除去信号肽并且在内质网和高尔基体中糖基化，前肽区域被裂解从而形成有活性的酶。天冬氨酸蛋白酶的生物学功能很广泛，包括：讲解抗原，促进其他酶的活化，位点特异性水解逆转录酶病毒前体蛋白以产生病毒体复制所必须的酶蛋白，调整血压，消化食物蛋白等等。目前，天冬氨酸蛋白酶已有胃蛋白酶亚型，逆转录蛋白酶亚型，天冬氨酸膜内裂解蛋白酶亚型被人们所研究，另外还有越来越多的新发现的酶。
对来自芽孢杆菌ym55-1的天冬氨酸酶aspb基因进行克隆，鉴定，并在原核系统中进行克隆表达。以芽孢杆菌的rna为模板，用rt-pcr法对aspb基因进行扩增，在大肠杆菌bl21(de3)中利用pet-28a载体表达带有his标签的来自芽孢杆菌ym55-1的天冬氨酸酶aspb。利用分光光度法测定蛋白浓度。
2. 研究内容和预期目标
在大肠杆菌中克隆并表达来自芽孢杆菌ym55-1的天冬氨酸酶aspb，测定对天然底物l-天冬氨酸的活力。
在大肠杆菌bl21(de3)中利用pet-28a载体表达带有his标签的来自芽孢杆菌ym55-1的天冬氨酸酶aspb（该蛋白的基因序列在embl数据库中的编号为ab028242，ncbi数据库中的编号为ab028242.1，采用外包基因合成获得）。
对获得的蛋白（以细胞破碎液的形式）利用天冬氨酸进行活力鉴定，检测方法为分光光度法（富马酸在240 nm下的消光系数为2.53×103 m-1cm-1）和hplc方法。
3. 研究的方法与步骤
1 搜索目标基因（来自芽孢杆菌ym55-1的天冬氨酸酶aspb）
2 利用基因重组方法，构建新的目标基因
3 对采用基因合成技术获得的基因进行大量扩增（pcr）
4. 参考文献
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[2] de langeb, hyett dj, maas pjd, mink d, van assema fbj, sereinig n, de vries ahm, devries jg. asymmetric synthesis of (s)-2-indolinecarboxylic acid bycombining biocatalysis and homogeneous catalysis. chemcatchem 2011,3: 289–292.
[3] weiserd, bencze lc, bánóczi g, ender f, kiss r, kókai e, szilágyi a, vértessy bg,farkas o, paizs c, poppe l. phenylalanine ammonia-lyase-catalyzed deaminationof an acyclic amino acid: enzyme mechanistic studies aided by a novelmicroreactor filled with magnetic nanoparticles. chembiochem 2015,16: 2283–2288.
5. 计划与进度安排
1 2022 11-2022 12 查阅文献，撰写开题报告和前言
2 2022 12-2022 02 大肠杆菌中克隆并表达来自芽孢杆菌ym55-1的天冬氨酸酶aspb
3 2022 03-2022 04 对获得的蛋白（以细胞破碎液的形式）利用天冬氨酸进行活力鉴定
