1. 研究目的与意义
1．研究的背景、目的及意义 |
背景 食用菌是营养丰富并兼有食疗价值的食品。近年来，食用菌作为一种绿色食品日益受到各国人民的重视，对食用菌的食用和药用价值研究愈来愈深入。食用菌中所含的真菌多糖是一类重要的保健食品功能因子，是当今医药和食品工业共同关注的焦点。目前,国内外对食用菌的研究多在进行多糖等生物活性物质的提取，并利用其抗癌活性制备新药，或利用其子实体的提取液制备保健食品、功能食品等方面。 茶树菇又叫茶薪菇，是一种被人们称为菇中珍品的食用菌。它是担子菌纲伞菌目类绣伞科的真菌微生物，它含有多种微量元素和人体所需要的１７种氨基酸，营养价值和药用价值比其它食用菌高出数倍以上,是一种具有较高营养价值的珍稀食药用真菌，其子实体富含氨基酸、多糖、微量元素等多种营养成分。研究发现，多糖是其中最主要的一类生物活性成分，与日常的食用菌平菇、金针菇、阿魏菇杏鲍菇等相比较，其多糖物质茶树菇含量达３００ｇ／ｋｇ干重以上，多糖含量高于蘑菇、香菇、草菇、平菇等其他食用菌。茶树菇具有抗肿瘤、抗衰老、增强免疫、降低胆固醇等功效，药用价值较高，是一类很有开发前景的珍稀食用菌种类。 茶树菇多糖具有较高药用价值。徐静娟等人所做的茶树菇多糖免疫作用的研究实验，以实验小鼠的溶血空斑数、T细胞刺激指数、自然杀伤细胞活性、巨噬细胞的吞噬指数等为指标，检测茶树菇多糖对实验小鼠免疫功能的影响。研究结果表明：茶树菇多糖能同时促进实验小鼠的非特异性免疫应答和特异性免疫应答，可提高实验小鼠的免疫功能。辛英姬等人的茶树菇多糖抑菌效果的试验结果表明：茶树菇多糖对细菌有一定的抑制作用，100mg/mL茶树菇多糖溶液对金黄色葡萄球菌抑制效果最明显。 通过改造茶树菇菌种和优化培养基可以提高茶树菇多糖的产量，而优化提取方案可以提高多糖的提取效率，保证茶树菇胞内多糖被尽量完全的提取出来。多糖提取的方法很多，如：水提取法、碱提取法、酸提取法、酶解法、超声波辅助法、微波辅助法等，其中水提取法和碱提取法在生产上应用较多，但是应用水提取法时间长且效率较低，而应用酸碱提取法易破坏多糖的立体结构、改变其生物活性。目前，研究最多的新型方法有超声波法、微波法、酶解法等，与经典提取方法相比，这些新型方法都有省时、节约溶剂、提取效率较高的特点，但是，由于需要特殊的仪器设备和生产成本较高，目前主要是在实验室小规模研究应用。如何优化这些提取方法，简化工艺、降低成本，使其能投入实际生产，已经成为研究的重点。 近几年来的大量实验研究表明，超声波作为一种物理能，能通过在空化作用中产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破裂而使胞内物质释放、扩散及溶解。在应用方面，利用超声波进行清洗、干燥、杀菌、雾化及无损检测等，是一种非常成熟且有广泛应用的技术。黄海云等以白芨块茎为原料提取白芨粗多糖，比较多种提取方法表明，室温下超声处理为较理想的提取方法。张文超等对金针菇子实体多糖的提取试验中，用超声波强化，可使多糖提取率提高76．22％。于淑娟等对超声波催化酶法提取灵芝多糖的机理、最优化方案及降解产品的组分和结构进行了系统的研究，并对虫草多糖、香菇多糖、猴头多糖的提取进行了研究，与传统工艺相比，超声波强化提取操作简单，提取率高，反应过程无物料损失和无副反应发生，是一种可望实用推广的新工艺。 目的及意义 本论文运用响应面法对超声波法的影响因素和水平进行优化，比较超声波处理温度，超声波功率，料液比，超声波处理时间，提取液的pH值等因素对多糖提取率的影响，通过响应面拟合曲线确定最佳的茶树菇多糖提取条件。为其工业化生产和提高利用价值提供基础数据。 |
2. 研究内容和预期目标
2．主要研究内容和预期目标 |
研究内容包括： （1）利用单因素实验确定最佳的超声波提取次数，利用Plackett－Burman设计考察超声波功率、超声波处理时间、提取温度、料液比、pH等因素对多糖提取率的影响，通过模型分析找寻较重要因素。 （2）利用爬陡坡试验，以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据因素效应值大小确定变化步长，快速逼近最优区域。 （3）利用Box－Behnken设计确定最佳的提取条件 预期目标： 本论文用超声波提取法提取茶树菇多糖。以多糖得率为指标，通过响应面法获得茶树菇多糖提取的最佳条件。 |
3. 研究的方法与步骤
3．拟采用的研究方法、步骤 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
实验方法及步骤 1实验前期准备工作： （1）准备实验药品和器具，未使用过的仪器学会正确操作使用； （2）将茶树菇干料研磨成粉末； （3）进行预实验，学习并熟练超声波法提取茶树菇多糖的方法和多糖测定的方法。 （4）设计实验表格 2实验过程： （1）研磨茶树菇粉末，用60目筛子过筛获得最终茶树菇粉末。 （2）确定固定的的超声波功率，提取时间，料液比，提取温度以及pH，多次提取多糖，每次提完检测其中多糖含量，确定实验提取次数。 （3）在提取次数固定情况下，设计PB试验对超声波提取茶树菇多糖的各个因素进行分析：
N=12时Plackett－Burman设计编码水平如下：
（4）按上述表格处理茶树菇多糖，获得的粗多糖提取液，测多糖得率。 （5）利用Design-expert对Plackett-Burman实验结果进行分析，筛选出影响最显著的因素。 （6）进行爬陡坡实验逼近优化区域 （7）响应面法确定最优条件，并预测多糖得率。 （8）使用最有条件进行验证试验。 多糖得率测法： 多糖得率测定公式：多糖得率(％)=(总糖含量-还原糖含量)/粉末质量 苯酚硫酸法 (1)试剂的配制 0.1mg/mL葡萄糖标准液的配制：准确称取烘干的分析纯葡萄糖0.1g，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后转移到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，混合均匀，4℃冰箱中保存备用[8]。 5%苯酚水溶液：取苯酚5g用蒸馏水定容至100mL，配成5%苯酚水溶液(置棕色瓶，冰箱冷藏)。 (2)葡萄糖标准曲线的制作： 取6支25mL试管编号，按下表分别加入浓度0.1mg/mL的葡萄糖标准液和蒸馏水，配成不同葡萄糖含量的反应液，冰浴的情况下分别加入0.5ml苯酚，再分别加入5ml浓硫酸，充分摇匀，沸水浴5min。再放入冰中冷却，并以0号管为空白参比测520nm处吸光值。 表1葡萄糖标准曲线的制作（苯酚-硫酸法） Tab1productofstandardcurveofglucose（Phenol-sulfuricacidmethod）
以OD值为纵坐标，葡萄糖含量(mg/ml)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。 (3)样品的总糖测定： 精密吸取稀释溶液1ml，在冰水浴中精密加入5%苯酚水溶液0.5ml、浓硫酸5mL，混匀，沸水浴2min，即时置于冷水浴冷却；另以蒸馏水代替葡萄糖标准溶液进行相同的反应作为空白参比测490nm下吸光值,得出总糖含量。 3,5-二硝基水杨酸法(DNS法) (1)试剂的配制 DNS溶液：将6.3g3,5-二硝基水杨酸和262mL2mol/LNaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中1周后稳定，备用。 1mg/mL葡萄糖标准液的配制：准确称取烘干的分析纯葡萄糖1g，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后转移到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，混合均匀，4℃冰箱中保存备用。 (2)葡萄糖标准曲线的制备：取6支25mL试管编号，按下表分别加入浓度1mg/mL的葡萄糖标准液和蒸馏水，配成不同葡萄糖含量的反应液，再加入3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂2ml，沸水浴5min，待冷却后，加入9ml蒸馏水，并以0号管为空白参比测520nm处吸光值。 表2葡萄糖标准曲线制作（DNS法） Tab2productofstandardcurveofglucose(DNS)
以OD值为纵坐标，葡萄糖含量(mg/ml)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。 (3)样品的还原糖测定： 精密吸取上清溶液1ml，精密加入DNS溶液2mL，摇匀，置沸水浴5min，取出后置于自来水冷却至室温，后加入9mL的蒸馏水，另以蒸馏水代替葡萄糖标准溶液进行相同的反应为空白参比测490nm下吸光值，得出还原糖含量。 |
4. 参考文献
4．主要参考文献 |
[1]史宝军,张家骊等.灰树花胞外多糖的分离纯化及其性质研究.药物生物技术. 2003,10(5):312～316 [2]徐翠莲,杜林洳.多糖的提取、分离纯化及分析鉴定方法研究.河南科学.2009,27(12):1524~1527 [3]肖怀秋，李玉珍.海金沙草粗多糖提取工艺的响应面优化.氨基酸和生物资源.2011，33(1):79～83 [4]马冯时，刘传冰.六西格玛管理统计指南MINTAB使用指导[M].北京：中国人民大学出版社,2007:466 [5]潘凤莲，彭述辉.超声波法提取凤眼莲多糖的工艺研究.安徽农业科学.2010，38(27)：1507415075 [6]齐香君.3,5-二硝基水杨酸比色法测定溶液中还原糖的研究[J].纤维素科学与技术.2004,12(3):17～19 [7]李成元,蔡晓.2种灵芝多糖含量测定方法的比较[J].中国药房,2009,20(18):1416～1417. [8]陈红漫，杭天骄，田秀艳等.苦瓜多糖抗氧化生物活性的研究[J].食品科技.2009,34,6.166-169 [9]许冰.株芽孢杆菌胞外多糖的抗氧化性研究.中国酿造.2010,8:75~76 [10]黄海云，张卫明，等．白芨粗多糖提取方法的比较研究[J]．中国野生植物资源，2001，20(1)：14～16． [11]张文超，蔡妙颜，等．物理波强化提取金针菇多糖[J]．食用菌，2001(1)：5～6． [12]于淑娟．超声波催化酶法提取灵芝多糖[D]．广州：华南理工大学，1996，1． |
5. 计划与进度安排
5．具体进度安排（包括序号、起迄日期、工作内容） |
1、2015-02-28～2015-03-31查阅文献，制定实验方案，撰写开题报告，学习软件使用； 2、2015-04-01～2015-04-15开始实验准备工作，进行预实验，熟悉实验方法； 3、2015-04-16～2015-05-30使用超声波法从茶树菇子实体中提取胞内多糖，确定最佳的提取方法； 4、2015-05-31～2015-06-25数据处理、写毕业论文、答辩等。 |
指导教师意见 |
指导教师： 年 月 日 |
