大肠杆菌对定向进化苍白杆菌糖异构酶的干扰研究开题报告

1. 研究目的与意义

本课题研究的背景、目的及意义

除d-葡萄糖等少数单糖外，多数自然界中存量稀少的单糖及衍生物被称“稀有糖/稀少糖”（rare sugars）。我国糖尿病患者超过一亿，肥胖人口数量也位居世界第一，稀有糖具有高甜度、低热量等特性，是良好的代糖，也可用于制备活性药物成分。现阶段，稀有糖主要由酶催化等生物技术方法制备。d-核糖-5-磷酸异构酶（d-ribose-5-phosphate isomerase, rpi, ec 5.3.1.6）底物范围广泛，可催化四至六碳底物，是制备稀有糖的主要工具之一。rpi的应用潜力推动了其分子改造工作，但迄今取得的进展有限。问题一为常见宿主如大肠杆菌含有干扰重组酶测活的野生型糖异构酶及糖代谢中间体，易错pcr等依赖高通量筛选的方法难以开展；尝试敲除宿主野生型rpi的工作结果也不理想。问题二为进化压力下rpi结构保守，与底物结合作用单一（氢键）活性中心残基常具有多种功能，理性设计改造活性中心的策略空间有限。

糖异构酶的随机突变-筛选流程的主要干扰来源为宿主内原生糖异构酶及单糖代谢产物两方面。为解决问题一，根据大肠杆菌的生长温度和实际应用中对酶温度稳定性的需要，本研究拟通过提高筛选温度以克服大肠杆菌内糖异构酶的干扰。在破壁筛选前将重组细胞静置，并施加高温处理可能会有效降低宿主内单糖代谢产物对目标产物的干扰，开发适合糖异构酶在大肠杆菌中进行随机突变的新方法。

2. 研究内容和预期目标

本实验根据预实验数据发现大肠杆菌RpiA和RpiB最适活性温度约为50^oC， 因此探索其在80^oC条件下的半衰期具有重要意义。如果其半衰期小于1小时，则在筛选过程中添加80^oC处理2小时可以大幅减少宿主糖异构酶的干扰。虽然高温处理也可降低大部分重组酶活力，但所筛选到的突变体将具有较高的热稳定性。此外还计划研究大肠杆菌内糖代谢产物的浓度变化，如在培养结束静置1-2 天后细胞破碎液中代谢物峰面积下降60%，则可以利用该步骤有效降低其对目标反应产物检测的干扰。上述工作的完成将为OsRpi在大肠杆菌中的随机突变介导的分子改造探索可行道路

3. 研究的方法与步骤

方法步骤：

1、菌种选择：大肠杆菌e. colibl21(de3)（不含重组基因）

2、菌体制备：

4. 参考文献

[1] eisenbenberg david, marcotte, edward m,et al .proteinfunction in the post-genomic era[j].nature, 2000,405(6788):823-826.

[2] barker wc, garavelli js, huang h, et al. the proteininformation resource (pir) [j]. nucleic acids research,2000,28(1):41-44.

[3] harger c,chen g,farmer a,huang,w.the genome sequence database[j].nucleic acids research,2000,28(1):31- 32.

5. 计划与进度安排

1. 2022 11-2022 12 查阅文献，撰写开题报告和前言

2. 2022 01-2022 02 完成野生型大肠杆菌糖代谢物残余情况的分析

3. 2022 03-2022 04完成野生型大肠杆菌糖异构酶残余活力的分析