温泉高产普鲁兰酶产生菌的酶学性质及诱变开题报告

1. 研究目的与意义

自50 年代末，Bender 等首先对出芽茁霉(pullularia pullulans)——一种不完全菌产生的粘多糖普鲁兰(又称茁霉多糖)的结构进行了研究，发现这是一种以α-1 , 6 糖苷键将麦芽三糖头尾相连而形成的多糖。1961 年，Bender 等进一步发现由产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)所产生的细胞外酶———普鲁兰酶(又称茁霉多糖酶)可以切断普鲁兰中的α—1 , 6糖苷键，而使普鲁兰转化成麦芽三糖。普鲁兰酶能够专一催化支链淀粉型多糖α-1 , 6 糖苷键的水解，从而使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链形成一系列链长不一的直链淀粉。将该酶与葡萄糖淀粉酶等配合使用，可使淀粉充分糖化。国内目前使用的普鲁兰酶基本上都是来自丹麦Novo No rdisk 公司，该公司所产的普鲁兰酶则是由普鲁兰杆菌(bacillus acidopulluly ticus)菌株经深层发酵产生。

普鲁兰酶主要使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链，从而加速糖化过程，有效的提高淀粉利用率和水解效率，降低能耗。在食品领域，通常与淀粉酶结合使用，生产果糖和麦芽糖糖浆。当普鲁兰酶以普鲁兰糖为原料时，水解产物主要是麦芽三糖糖浆，其在食品工业中有重要应用价值，与麦芽糖浆、葡萄糖浆等相比，其优势主要体现在：抑制食品的冰点凝固、赋予柔和的甜度、增加持水性、防止淀粉重结晶、减少色素形成等。因此，普鲁兰酶可以在焙烤食品、甜点以及医药注射代替葡萄糖等领域中应用，在生物能源方面，以淀粉等生物质资源开发乙醇、丁醇等生物燃料也是当前能源开发的热点，这说明普鲁兰酶具有广泛的工业应用价值。

普鲁兰酶广泛分布于丝状真菌、细菌、酵母、植物

和动物中，如芽孢杆菌，厌氧芽孢杆菌，水栖热袍菌，巴伦葛兹类芽孢杆菌。然而，由于酶在产量、稳定性及特殊环境下的活性等局限，用于工业化生产的普鲁兰酶非常有限。

目前，很多研究报道了不同特性的普鲁兰酶，如嗜热栖热菌来源的耐热性达到70 ℃的普鲁兰酶；来源于嗜碱芽孢杆菌的耐受表面活性剂的普鲁兰酶。虽然有不同特性的普鲁兰酶报道，但是特性单一，不能满足对多种特性需求的工业化生产需要，如目前淀粉糖化过程一般在60 ℃高温和pH4.5 的弱酸性条件下进行48～60 h，在此过程中普鲁兰酶不仅要维持高的催化活性还要保持高稳定性，而根据文献，符合这种多元化条件的普鲁兰酶非常有限。

本文通过对一株温泉高产普鲁兰酶产生菌进行诱变，为后期对普鲁兰酶的性质及动力学研究奠定了基础。

2. 研究内容和预期目标

1. 一株温泉高产普鲁兰酶产生菌进行诱变

2. 温泉高产普鲁兰酶诱变菌的酶动力学测定

3. 研究的方法与步骤

1、实验材料

1.1试剂配制

（1）dns试剂：称取酒石酸钾钠122.1674g，放入400ml去离子水中，加热溶解后再加入3，,5二硝基水杨酸3.15g，继续加热溶解后加入氢氧化钠10.5g，加热溶解后加入苯酚2.5g，加热溶解加入na₂so₄·7h₂o 4.9972g(期间加热温度控制在60c℃以内)，冷却后去离子水定溶至500ml，贮于棕色瓶中避光保存，放置2周后使用。

4. 参考文献

[1] bender h, lehmann j, wallenfels k . pullulan, an extracellular g lucan from pullularia pullulans [j]. biochim biophys acta, 1959, (36): 309-316

[2] bender h, wallenfels k. untersuchungen and pullulan.Ⅱ, spezifischer abbau durch ein bakterielles [j].enzym biochem z, 1961, (334):79-95

[3] 高涛, 王芳, 别小妹, 等. 产耐热普鲁兰酶菌株的分离、筛选与鉴定[j]. 食品科学, 2017, ( 8) : 117-121.

5. 计划与进度安排

1、2022-2022-1学期17-20周～2022-2022-2学期1-2周（2022-12-28~2022-3-14），接受任务、查阅和翻译文献，撰写开题报告；

2、第3周~第5周（2022-3-15～2022-4-4），完成实验前准备工作，配制各实验所需药品。

3、第6周~第7周（2022-4-5～2022-4-18），预实验