1. 研究目的与意义
水稻作为世界上最为重要的粮食来源之一。水稻最常见的疾病就是稻瘟病（riceblast），稻瘟病是由稻温病菌（pyriculariaoryzae cav.）引起的一种真菌性水稻病害。稻瘟病的主要危害是造成水稻减产，通常造成水稻产量损失10%~20%，有的损失高达一半，甚至部分地区颗粒无收。上世纪90年代以来，稻瘟病在我国爆发频繁，年爆发面积平均达到380万公顷左右，损失稻谷数百万吨。
长期以来，防治稻瘟病的手段主要有使用化学农药、培育抗稻瘟病生理小种，加强田间管理等。其中化学农药凭借其防治效果好，见效快，杀菌谱广，低成本和使用方便等特性成为使用范围最广的一种手段。但是化学农药可能会导致果实农药残留量高，对人畜造成危害，降低了辣椒的食用安全性和商品价值，也容易造成环境和食品污染，也易引发植物病原菌的抗药性。因此，越来越多的人选择利用低碳环保的生物防治方法来控制植物病虫害的发生。国内外研究人员把防治重点逐步转向生物防治。在中国，放线菌作为生物防治因子在水稻、果树、蔬菜等作物病害防治上有许多报道。从天然植物中提取天然抑菌防腐物质，提取条件和工艺皆可控制，且天然植物来源十分丰富，筛选具有抑菌活性的中草药或植物提取物，并应用于果蔬防腐保鲜已成为当今研究的热点(曾荣等，2011)。
植物源农药具有低毒、无残留、选择性高，不易使害虫、病菌产生抗药性的特点，是一种与环境有良好相容性的新型环保农药。目前很多植物已经成为农药的直接来源，如银杏对多种病原菌具有明显的抑菌杀菌作用；杨胜远等研究了40种中草药提取物对芒果蒂腐病的抑菌作用，发现五倍子对病原菌的抑菌效果最好。此外，山苍籽油配置的乳剂对茶树主要病害茶红锈病、茶云纹叶枯和棉花枯萎病等有较好的防治效果。
2. 研究内容和预期目标
本文拟开展油茶粕提取物复配的微乳化及其抗稻瘟病的稳定性研究。主要内容如下：
1. 不同微乳剂乳化对油茶粕复配提取物溶解性，伪三元相图的绘制和D-最优混料设计
2. 不同温度和紫外照射处理下油茶粕复配提取物乳化对稻瘟病菌细胞生长、形态及生理生化指标影响3. 研究的方法与步骤
| 1、实验材料 马铃薯，葡萄糖，琼脂，95%乙醇，石油醚，硝酸钾，磷酸氢二钾，硫酸镁，蛋白胨，酵母提取物，氢氧化钠溶液，氯化氢溶液，酒石酸钠，DNS试剂，苯酚，3,5-二硝基水杨酸，亚硫酸氢钠，対二甲氨基苯甲醛，冰醋酸，浓盐酸，几丁质，考马斯亮蓝G-250，乳酸酚棉蓝染色液，85%浓磷酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，N-乙酰葡萄糖胺，硼酸钾，双氧水，愈创木酚，单甘脂，Tween-80,司盘80（以上均为分析纯药品） 1.1试剂配制 （1）DNS试剂：称取酒石酸钾钠122.1674 g，放入400 mL去离子水中，加热溶解后再加入3, 5二硝基水杨酸3.15g，继续加热溶解后加入氢氧化钠10.5g，加热溶解后加入苯酚2.5g，加热溶解加入Na2SO4·7H2O4.9972 g(期间加热温度控制在60℃以内)，冷却后去离子水定溶至500 mL，贮于棕色瓶中避光保存，放置2周后使用。 （2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100 mg考马斯亮蓝G-250置于烧杯中，向其中加入90%乙醇50 mL溶解，再向其中加入100 mL 85%的磷酸，最后，蒸馏水定容至1000 mL（可常温放置一个月）。 （3）磷酸缓冲溶液(pH6.0、0.2 M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)：将配制好的0.2M磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液以12.3：87.7比例混合。 （4） 1%对二甲氨基苯甲醛（DMAB）：取70 mL冰醋酸与10 mL浓盐酸混合均匀后，再加入8g对二甲氨基苯甲醛,溶解后制得DMAB储存液。用冰醋酸稀释至需要百分比。（现配现用） （5） 0.5%胶状几丁质：去一定量条状几丁质用粉碎机磨碎，精确称取0.8 g碎屑于烧杯中，向烧杯中缓慢加入30 ml 4℃预冷的浓盐酸溶液，用玻璃棒迅速搅拌使碎屑与浓盐酸充分接触，再将烧杯放到37℃超声波清洗器中，超声溶解2h（看溶解状况，待几丁质完全溶解，溶液清亮透彻即可）。向溶解的几丁质溶液倒入4℃预冷的蒸馏水320mL,迅速搅拌至溶液呈乳白色。将该悬浮液置于4℃冰箱中低温静置保存过夜，次日可看到白色胶状沉淀，用移液枪除去上清液。加入蒸馏水洗涤沉淀，4000 r低温离心机，离心20min,弃上清，反复用蒸馏水洗涤离心至pH接近5.0，再用1 mol/L氢氧化钠校正pH至中性，加入200 ml蒸馏水，剧烈搅拌使几丁质均匀分散成悬液，既得几丁质胶体溶液。 （6） N-乙酰葡萄糖胺标准溶液：称取30 mg N-乙酰葡萄糖胺，加入适量蒸馏水使其完全溶解，最后定容到100 mL即可。 （7） 蛋白质标准液（100 ug/mL）:精确称取10 mg牛血清蛋白，用蒸馏水溶解定容至100 mL。 （8） 葡萄糖标准液[36]：精确称取200mg葡萄糖，用蒸馏水溶解定容至100 mL。 1.2培养基配制 （1） 马铃薯固体培养基（PDA）：称取去皮土豆200g，切丁后放于搪瓷杯中，加入300-500 mL蒸馏水，煮至搅拌时无颗粒感，用四层纱布过滤，用蒸馏水将滤液定容至1000mL,继续加热至微沸后加入20g葡萄糖，再边搅拌便加入15g琼脂（使其完全溶解）。分装包扎后121℃灭菌20 min备用。 （2） 马铃薯液体培养基（PS）：称取去皮土豆200g，切丁后放于搪瓷杯中，加入300-500 mL蒸馏水，煮至搅拌时无颗粒感，用四层纱布过滤，用蒸馏水将滤液定容至1000 mL。继续加热至微沸后加入20g葡萄糖，溶解后分装包扎，121℃灭菌20 min备用。 （3） 察氏液体培养基（CM）：称取3 gKNO3 ，1 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，10 g蛋白胨，5 g酵母提取物，20g葡萄糖，将上述药品加入搪瓷杯中，加入适量蒸馏水溶解，再定容至1000 ml,调节pH至5.6~5.8，分装包扎，121℃灭菌20 min备用。 培养基灭菌条件：高压蒸汽灭菌锅121℃，灭菌20 min。 2、实验方法 2.1 菌种活化 将实验菌种接种于活化的PDA固体培养基上，将平板放在恒温培养箱中培养，温度设置28℃，培养时间设定在4-6天，使菌种活化，备用。 2.2 制备油茶粕提取物 （1） 油茶粕初处理：将油茶粕饼清扫除去尘土，叶片，用锤子将茶饼砸成小块，再将小块油茶粕饼放在干粉粉碎机中打碎，收集油茶粕碎屑，用80目的筛子筛取粉末，储存在干燥洁净的瓶子中。 （2） 油茶粕的去脂：采用索式提取法，称取10 g油茶粕粉末包在脱脂滤纸包中（自行折叠，可放入提取管，不外漏即可），放入提取管中，向提取瓶（250 mL磨口原底烧瓶）内加入150 mL石油醚，依次连接固定提取瓶，提取管和冷凝管，80℃水浴去脂2~3 h。将去脂的油茶粕粉末包放于80℃烘箱烘干，干燥后的粉末即为去脂油茶粕。（使用过的石油醚于50℃旋转蒸发回收利用）。 （3） 油茶粕的浸提：采用回流提取法，称取10 g去脂油茶粕粉末加入250 mL磨口原底烧瓶中，加入150 mL的95%乙醇，水浴回流3~4 h，温度设置80℃。将浸提混合液用8层纱布（内部夹层棉花）过滤，收集滤液，即油茶粕浸提液。 （4） 油茶粕的旋蒸浓缩：将滤液装入旋转瓶中（不可超过瓶容量的二分之一），40℃，80 r/min旋转蒸发，到瓶内液体浓缩到15 mL左右停止，将浓缩液倒入大口径培养皿，用保鲜膜密封，放入-80℃冰箱中冷冻过夜。将冷冻过夜的培养皿取出，在保鲜膜上均匀大量戳孔透气，再迅速放入预冷半小时的冷冻干燥机中冻干，粉末刮下置于干燥洁净的棕色瓶中储存备用。 （5） 配置浓度梯度油茶粕提取物溶液：称取油茶粕提取物，用无菌水配置成工作浓度为2、5、10、20、40 mg/mL油茶粕提取物母液，用0.22 um的滤膜过滤，4℃保存备用。 2.3 微乳化 分别加入Tween-80,司盘80，单甘脂做表面活性剂进行微乳化，再按照不同比例进行复配。 2.4 诱变处理 设置不同梯度的温度和紫外照射时间对油茶粕提取物复配的微乳化产物进行处理。 2.5 油茶粕提取物复配的微乳化对稻瘟病菌的抑制效果试验 （1） 工作培养基的制备 将油茶粕母液与PDA培养基以1：9的比例混合均匀，再将上述混匀的含不同浓度油茶粕母液的培养基倒入灭菌的培养皿中，对照组用无菌水代替油茶粕母液进行处理，贴标签，冷却凝固，备用（注意使培养基中油茶粕提取物浓度为实验设置浓度，即工作浓度）。 （2） 接种处理 采用抑制菌丝生长速率法：用直径1cm打孔器在生长良好的活化稻瘟病菌平板上打菌圆片，将菌圆片缓慢小心倒扣在各浓度培养皿的中央，用镊子稍稍按压菌圆片，使之与培养基充分接触（动作尽量小，不要在培养皿上移动菌圆片，防止孢子飞散，影响实验效果）。每个浓度设置三个重复，将培养皿放置在28℃恒温培养箱中培养，每天观察记录各处理组的菌落直径并摄影（采用十字法测量，每组取平均值），直到对照组的培养皿长满为止。计算菌落平均直径和平均抑菌率。 抑菌率=对照组菌落直径-处理组菌落直径对照组菌落直径-接入菌块直径×100% 2.6 油茶粕提取物复配的微乳化对稻瘟病菌菌丝体的影响 采用悬滴法：将油茶粕母液与PDA培养基以1：9混合均匀，制备工作浓度为0、2、5、10、20、40 mg/mL的抑菌培养基（对照组用无菌水代替油茶粕母液），用直径1cm打孔器在生长良好的活化稻瘟病菌平板上打菌圆片，将菌圆片缓慢小心倒扣在各浓度培养皿的中央，每个浓度设置三个重复，将培养皿放置在28℃恒温培养箱中培养5天。之后取出用灭菌洁净的接种环轻轻刮取培养皿上的菌丝体，在载玻片上滴1滴无菌蒸馏水，将菌丝体浸于水中，干燥后滴加乳酸酚棉蓝染色液染色，显微镜下观察拍照并记录。 2.7 油茶粕提取物复配的微乳化对稻瘟病菌细胞壁完整性的影响（1） 菌悬液的制备配置液体CM培养基，将其分装在250 mL洁净的锥形瓶中，每瓶80 mL,再向各瓶中放置20颗玻璃珠，121℃灭菌20 min备用。用直径1cm打孔器在生长良好的活化稻瘟病菌平板上打菌圆片，将菌圆片放入上述液体培养基中，28℃恒温培养箱培养三天，每12 h左右震荡一次，避免菌丝粘连。三天后，将液体培养基放于25℃摇床，200 r/min培养30 min,使菌丝体充分破碎，得到菌悬液。 （2） 菌丝初提液的处理 准备洁净的试管若干，按照浓度梯度的顺序各取8ml油茶粕母液于试管中（用无菌水做对照组），并对它们进行编号。再向各管中加入2ml菌悬液，将其混合均匀后，依次在静置处理0、8、16、24、32、40h后取样，将样品12000r/min离心10min,留取上清液于4℃冰箱保存备用。 （3） 测定油茶粕提取物复配的微乳化产物处理下N-乙酰氨基葡萄糖的含量 ① 制备N-乙酰葡萄糖胺的标准曲线 准备洁净的试管6支，依次编号0`~5`，按照下表的数据分别加入N-乙酰葡萄糖胺标准液和蒸馏水，震荡混匀。再从相应各管分别取0.1ml溶液于新的试管中,对应依次编号0~5，再加入0.5 mL 0.8 mol/L硼酸钾，沸水浴3 min,用冷水快速冷却至室温后，向各管中加入3 mL质量分数为1%的DMAB，于36℃水浴保温20 min。在冷却后于波长544 nm处测定OD值，每组测定三个重复。 表2.2 N-乙酰葡萄糖胺标准曲线的测定 Table 2.2 Determination of N-acetyl glucosamine calibration curve LINK Excel.Sheet.12 C:\\Users\\yongl\\Desktop\\论文\\曲线\\糖曲线.xlsxSheet1!R9C10:R13C16 \a \f 4 \h \*MERGEFORMAT
② N-乙酰葡萄糖胺测定 取各浓度菌丝处理组的上清液0.1 mL于洁净的试管中，分别向各管加入0.8 mol/L的硼酸钾0.5 mL，沸水浴3 min,用冷水快速冷却至室温后，向各管中加入3 mL质量分数为1%的DMAB，于36℃水浴保温20 min。在冷却后于波长544 nm处测定OD值，每组设置3个重复。 根据标准曲线，将OD值换算为N-乙酰葡萄糖胺的含量，进行分析总结。 （4） 测定油茶粕复配的微乳化处理下稻瘟病菌的几丁质酶的活性[40] 取各浓度菌丝处理组的上清液0.6 mL于洁净的试管中，分别向各管中加入0.5%的胶状几丁质0.6 mL,37℃水浴保温1 h后，沸水浴5 min灭活。然后5000 r/min离心10 min，依次取上清液0.6 mL于新的试管中，再向各管加入0.8 mol/L硼酸钾溶液0.3 mL，沸水浴煮沸3 min。冷却后再向各管加入2.5 mL的1% DMAB，混匀后36℃保温20 min，在冷却后于波长544 nm处测定OD值，每组设置3分个重复。以吸光度值的变化表征几丁质酶活的大小。 2.8 油茶粕提取物复配的微乳化对稻瘟病菌细胞膜完整性的影响（1） 菌丝提取液的处理： 准备洁净的试管若干，按照浓度梯度的顺序各取8 mL油茶粕母液于试管中（用无菌水做对照组），并对它们进行编号。再向各管中加入2 mL菌悬液（同2.5.4的菌悬液制备方法），将其混合均匀后，依次在静置处理0、2、4、6、8后取样，将样品12000 r/min离心10 min,留取上清液于4℃冰箱保存备用。 （2） 测定稻瘟病菌菌丝体可溶性糖的泄漏状况 ① 制备葡萄糖标准曲线 取洁净的试管7支，依次编号0’~6’，按照下表数据依次加入葡萄糖标准液和蒸馏水，再向各管中加入2 mL DNS试剂，充分震荡混匀，沸水浴5 min，用冷水快速冷却至室温后，用蒸馏水定容至15 mL，震荡混匀后，于波长540 nm下测定吸光值，每组测定3个重复。 表2.3 葡萄糖标准曲线的测定 Table2.3 Determination of glucosecalibration curve
② 菌丝体可溶性糖含量的测定 采用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖，取各浓度菌丝处理组的上清液200ul于洁净的试管中，分别向各管加入400 uL DNS，充分震荡后沸水浴5 min,用冷水快速冷却至室温后，用蒸馏水定容至3 mL。在冷却后于波长540 nm处测定OD值，每组设置3个重复。 根据标准曲线，将OD值换算为还原糖的含量，进行分析总结。 （3） 测定稻瘟病菌菌丝体可溶性蛋白的泄漏状况 ① 制备蛋白质标准曲线 准备洁净的试管6支，依次编号0~5，按照下表的数据分别加入蛋白质标准液和蒸馏水，震荡混匀。再从相应各管分别取0.2 mL溶液于新的试管中,对应依次编号0~5，再加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分震荡混匀，静置5 min后于波长595 nm处测定OD值，每组测定三个重复。 表2.4 蛋白质标准曲线的测定 Table.2.4 Determination of proteincalibration curve
② 菌丝体可溶性蛋白含量的测定 采用考马斯亮蓝（G-250）法测定蛋白质的含量，取各浓度菌丝处理组的上清液100 uL于洁净的试管中，分别向各管加入900 uL蒸馏水，再加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分震荡，静置5 min后于波长595 nm处测定OD值，每组设置3个重复。 根据标准曲线，将OD值换算为蛋白质的含量，进行分析总结。 2.9 油茶粕提取物复配的微乳化对稻瘟病菌细胞膜通透性的影响采用电导法，通过电导率大小分析细胞膜通透性的变化。准备灭菌的250 mL锥形瓶若干，向其中加入72 mL马铃薯葡萄糖液体培养基，依浓度顺序向各瓶中添加8 mL油茶粕提取物母液，并贴好标签，对照组用等量无菌水处理，每个浓度设置三个重复。用直径1cm打孔器在生长良好的活化稻瘟病菌平板上打菌圆片，将菌圆片放入上述液体培养基中，25℃，130 r/min恒温摇床培养，分别在0 h、24 h、48 h、72 h取5 mL培养液于洁净试管中，用电导仪测定电导率值，记录并分析。2.10 油茶粕提取物复配的微乳化对稻瘟病菌代谢状况的影响准备灭菌的250 mL锥形瓶若干，向其中加入72 mL马铃薯葡萄糖液体培养基，依浓度顺序向各瓶中添加8 mL油茶粕提取物母液，并贴好标签，对照组用等量无菌水处理，每个浓度设置三个重复。用直径1cm打孔器在生长良好的活化稻瘟病菌平板上打菌圆片，将菌圆片放入上述液体培养基中，25℃，130 r/min恒温摇床培养7天。 （1） 对稻瘟病菌POD酶活的影响 ① 反应液配置：取pH=6.0的磷酸缓冲液50 mL，向其中加入28 uL愈创木酚，加热搅拌至愈创木酚完全溶解，待溶液冷却后，加入19 uL的30%过氧化氢，混合均匀，冷藏保存备用。 ② 测定稻瘟病菌的POD酶活：采用可见光吸收法,从上述各浓度锥形瓶取2 mL培养液于洁净的研钵中，加入4 mL预冷的磷酸缓冲液（pH=6.0）冰镇研磨成均浆。浆液4000 r/min低温离心15 min，取上清液1 mL于试管中（对照组用pH=6.0的PBS溶液代替上清液），加入3 mL反应液，常温反应5 min后立即于波长470 nm的分光光度计测定OD值。设每分钟减少0.002 A为一个POD活力单位（U）。 （2） 对稻瘟病菌CAT酶活的影响 采用紫外吸收法：从上述各浓度锥形瓶取2 mL培养液于洁净的研钵中，加入6 mL预冷的磷酸缓冲液（pH=7.5）冰镇研磨成均浆。浆液3000r/min低温离心20 min，取上清液4 mL于试管中（对照组用pH=7.5的PBS溶液代替上清液），加入1 mL反应液（2% H2O2），将混合液稀释10倍于常温反应10 min后立即于波长240 nm的紫外分光光度计测定OD值。设每分钟减少0.001 A为一个CAT活力单位（U）。 |
4. 参考文献
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5. 计划与进度安排
| 1、2022-2022-1学期17-20周～2022-2022-2学期1-2周（2022-12-28~2022-3-14），接受任务、查阅和翻译文献，撰写开题报告； 2、第3周~第5周（2022-3-15～2022-4-4），完成实验前准备工作，配制各实验所需药品。 3、第6周~第7周（2022-4-5～2022-4-18），预实验。 4、 第8周~第10周（2022-4-19～2022-5-9），不同微乳剂对油茶粕复配提取物的效果。 5、第11周~第13周（2022-5-10～2022-5-28），不同温度和紫外照射处理下，微乳化油茶粕复配提取物对稻瘟病菌细胞生长、形态及生理生化指标影响。 6、第14周~第15周（2022-5-31～2022-6-11），完成论文撰写工作与答辩。 |
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