恶臭假单胞菌伴侣蛋白DnaK缺失菌株的构建开题报告

 2022-04-09 09:04

1. 研究目的与意义

1.研究背景

恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)是鱼的一种致病菌,常从腐败的鱼中检出,伴侣蛋白dnak,在mhp中表达为65kd的蛋白,在mhp蛋白翻译后的构象维持和功能的行使上起到了重要的作用,并具有免疫优势抗原的特性。其c端具有较强的免疫原性,可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫的发生,并具有分子伴侣和免疫佐剂的功能。

分子伴侣蛋白(chaperone)原先定义为一组无关的蛋白质种类,它们介导蛋白质的正确装配,而其自身不是最终功能的成份,它们中的许多被分类为应激蛋白,虽然它们在正常的条件下也有基本功能。最近分子伴侣蛋白被定义为一类蛋白质,它们结合并稳定另一个不稳定蛋白质底物,通过控制结合与释放帮助它在体内的正确折叠、多聚体装配、转运至一特定的细胞池或通过降解清除分子伴侣蛋白不包含使其底物蛋白正确特异折叠的空间信息,而是通过预防在非天然状态之间或其内部的不正确结合,增加蛋白质正确折叠的产率,而不增加其折叠的速度,这使其区别于所谓的折叠催化剂,如蛋白二琉键异构酶等。虽然最早分子伴侣蛋白术语的出现与描述核蛋白核质素在推动染色质装配中的特异功能联系在一起,而我们对分子伴侣蛋白在蛋白折叠中作用的理解主要始于对hsp 70家族及分子伴侣素(chaperonins,hsp 60,groel)家族的研究,基于它们显著的热诱导性,推测hsp 70家族帮助在应激状态下变性多肤的修复及降解;同时发现hsp 70在er囊腔中的类似物bip与没有装配的免疫球蛋白链及其他分泌蛋白相连,提示hsp 70在非应激条件下对稳定新合成多肤的折叠及装配中间体有重要的作用;同样地在酵母菌胞浆内hsp 70与新生的祖先多肤暂时连接,稳定其结构以利于其摄入线粒体及er中。

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2. 研究内容和预期目标

1.研究内容

本实验主要从以下几个方面研究恶臭假单胞菌伴侣蛋白dnak的功能研究作用:

(1)为研究atp依赖的hsp70伴侣功能,本实验首先确定atp.adp转换反应发生的部位。用糜蛋白酶酶切hsp70,纯化了44.kd蛋白片段,检钡jj44kd蛋白片段催化的atp水解和atp合成活性。

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3. 研究的方法与步骤

1.恶臭假单胞菌的培养

(1)恶臭假单胞菌富集:从鱼养殖车间,取10g循环水水处理系统生物滤池底部的生物填料。生物填料加入装有100ml液体富集培养基的无菌蓝盖瓶中,测定富集培养基的起始硝酸盐氮浓度,在低温摇床上20℃培养48h后,每24h测定富集培养基中的硝酸盐氮浓度,当硝酸盐氮浓度下降达90%以上时,菌液用于细菌分离。

(2)富集培养基(g/l):knac4h4o6·4h2o、kno3、k2hpo4、mgso4·7h2o,单蒸馏水配制,ph 7.2~7.6,121℃灭菌30min。

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4. 参考文献

[1]焦凌霞. dnak基因调控酸土脂环酸芽孢杆菌嗜酸耐热生理特性研究[d].西北农林科技大学,2012.

[2]miranda p. collier,justin l.p. benesch. small heat-shock proteins and their role in mechanical stress[j]. cell stress and chaperones: an integrative journal of stress biology,medicine and the environment,2020,25(4).

[3]梁正敏,宋银娟,董玉慧,等.hspx的功能及其在结核疫苗研制中的应用进展[j].中国人兽共患病学报,2020,36(11):956-961 968.

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5. 计划与进度安排

2022~2022年度(1~20周):

1.第1~2周:接受任务书,查阅资料,准备开题报告,外文论文翻译。

2.第3~4周:综合相关文献资料,撰写开题报告,完成实验前准备工作,搜索与实验相关的论文与材料。

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