1. 研究目的与意义
能源是推动社会、经济发展与进步的核心动力。目前，我们所利用的能源主要是有限的且不可再生的化石燃料及其转化能。随着石油资源的日渐枯竭和环境恶化带来的生存危机，生物质原料的竞争优势愈加显现，生物质原料的开发利用受到世界各国的高度重视，研究基于植物原料的新工业产品和拓展植物原料在工业生产中的应用是实现可持续发展的途径之一。
乳酸作为一种古老而重要的有机酸，自 1780 年首次被发现至今，已广泛应用于食品、医药、农业和化工等方面[1]。当前，l- 乳酸也可以作为原料大规模地应用于可生物降解塑料、氧化化学品、绿色化学品和溶剂，以及植物生长调节剂等方面。所以，对 l-乳酸的研究和生产已引起了国内外的重视。
工业上乳酸的生产有发酵法和化学合成法[2]。化学法是以乙醛和氢氰酸为原料合成的,生产成本高、 环境污染严重,且难于合成单一构型的 l-乳酸,目前已逐渐被绿色环保的微生物发酵法所取代。微生物发酵生产 l-乳酸的优势明显,原料廉价,生产工艺更加清洁,生产效率更高。
2. 国内外研究现状分析
1.木糖产l-乳酸的微生物
首先，目前应用发酵法产l-乳酸常用的微生物有两大类：乳酸菌（lab）和根霉菌属。在lab中常用于乳酸生产的有四种：乳杆菌属，链球菌属，芽孢杆菌属和肠球菌属。据报导所知：米根霉以木糖为唯一碳源产l-乳酸[1]：⑴木糖浓度对米根霉发酵产 l- 乳酸的影响：在ph自然值条件下，以木糖为唯一碳源，发酵72 h 后取样，测定l- 乳酸产量。发现木糖质量浓度为 20~100 g/l时，发酵 l- 乳酸产量随木糖浓度的增加而增加；木糖质量浓度为 100 g/l时，l- 乳酸产量最高；当木糖浓度超过 100 g/l时，发酵 l- 乳酸的产量随木糖浓度的增加而降低，可能是因为高浓度的木糖抑制了菌体生长，从而使 l- 乳酸产量下降。因此高浓度木糖对米根霉生长有抑制作用，木糖为唯一碳源时的最佳质量浓度为 100 g/l。⑵米根霉利用木糖发酵的过程曲线：在 ph 自然值条件下，以木糖最佳发酵浓度配制培养基，发酵 144 h，每隔 12 h 取样测定 l- 乳酸产量及生物量。当以木糖 （质量浓度为 100 g/l ） 为碳源时，发酵前 24 h 的l- 乳酸产量很低，为产物形成延滞阶段；在 24~120 h，随发酵时间的延长，生物量逐步提高，此过程中 l- 乳酸的产量随生物量的提高而同步提高，说明 l- 乳酸生产过程与菌体生长部分偶联；发酵 120~132 h 期间，l- 乳酸产量趋于稳定；发酵 132 h 时 l- 乳酸产量达到最大，为71.55 g/l，此时生物量也最高，为 4.723 6 g/l；发酵至 144 h 生物量下降，部分菌体可能衰亡，此时 l-乳酸的产量也下降，分析原因可能是在木糖消耗尽的同时，米根霉利用了 l- 乳酸。同期比较于葡萄糖，米根霉利用葡萄糖发酵生产 l- 乳酸时，葡萄糖为 120 g/l发酵 60 h 即能达到发酵终点，且乳酸生产率最高可达 90%，相对而言利用木糖 发酵产 l- 乳酸时，发酵周期延长至 144 h，乳酸最高产率仅为 71.55%，也就是说米根霉利用木糖的速度较慢。
一株细菌利用木糖产l-乳酸（此细菌属肠杆菌科）[4]：⑴种子生长曲线：100 ml种子培养基( 200 ml三角瓶装 )接入10% 16 h种龄的菌种 , 52℃、 160 r /min培养可知该菌的延迟期约为 6 h, 6 - 16 h为对数生长期 , 16 h进入稳定期。⑵种子培养基装载量的确定：于装有不同体积种子培养基的三角瓶中接入10%的一级种子 , 52℃、 160 r /min培养 16 h,用此种子液接种发酵，测定种子液 od660 nm以及发酵液 l-乳酸产量。结果表明 , 200 ml三角瓶装载 100 ml培养基制成的菌种发酵效果最好。⑶木糖浓度对 l-乳酸发酵的影响：用含 5% - 9%木糖的发酵培养基进行发酵，当木糖从 5%增加到 7%时 , l-乳酸产量随糖浓度的升高而增加 ,之后 ,产酸量降低;糖酸转化率随糖浓度的升高而降低。综合产酸量和糖酸转化率 2个指标 ,糖浓度以 6%较合理。⑷蛋白胨、 酵母浸粉、 牛肉膏的优化组合：正交实验方案可知对 l-乳酸产量影响顺序为蛋白胨﹥酵母浸粉﹥牛肉膏。当蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏分别为 5.0 g/l、3.0 g/l、2.0 g/l时l-乳酸产量最高。⑸mn2 、 m g2 、 fe2 的优化组合：正交实验方案可知对 l-乳酸产量影响顺序为mn2 ﹥ mg2 ﹥ fe2 。当其浓度分别为 0.04 g/l 、0.20 g/l、 0.05 g/l时 , l-乳酸产量最高。⑹接种量对 l-乳酸发酵的影响: 采用优化培养基 (蛋白胨 5.0、 牛肉膏 2.0、 酵母浸粉 3.0、 k2hpo4 2.0、mn2 0.04、 mg2 0.20、 fe2 0.05、 木糖 60,g/l) , 250 ml输液瓶装 150 ml,接入5% - 25%菌种 ,发酵。当接种量为 10%时 l-乳酸产量最高,达 (54.78 0.50) g/l。⑺发酵时间对 l-乳酸发酵的影响：250 ml输液瓶装 150 ml优化培养基 ,接入 15ml菌种发酵。发酵 72hl-乳酸产量最高 ,为 ( 55.67 0.34) g/l, 96h l-乳酸含量轻微下降;发酵 48h与发酵 72h的 l-乳酸产量差异不显著。⑻发酵温度对 l-乳酸发酵的影响：250 ml输液瓶装 150 ml优化培养基 ,接种量10% ,于不同温度下发酵。该菌具有较高的发酵温度和较宽的温度范围 ,从 46 - 52℃, l-乳酸产量均较高 ,在 46℃ 时最高 ,为 (57.62 0.42) g/l。⑼发酵液装载量对 l-乳酸发酵的影响：250 ml输液瓶分别装不同体积优化培养基 ,接种量 10% ,于 46℃、 160 r /min发酵 48 h，发现装载 150 ml时 l-乳酸产量最高 ,达 ( 57.35 1.05) g/l,该结果高于目前所报道的细菌菌株产酸水平。⑽碳源利用：实验发现，l t可以利用木糖、 葡萄糖、 l-阿拉伯糖、d-甘露糖产 l-乳酸 ,转化率 88.0%- 98.7%,不利用 d-阿拉伯糖和乳糖产 l-乳酸。⑾利用玉米芯酸解液发酵 l-乳酸：用含 6%还原糖的玉米芯水解液 (ph 5.0)代替优化培养基中的木糖 , 250 ml发酵瓶装 150 ml培养基,接种量 10% , 46℃、 160 r /min厌氧发酵 48h, l-乳酸产量为 (31.30 0.24) g/l。
3. 研究的基本内容与计划
针对上述一些现状和问题，我会利用诱变之后的凝结芽孢杆菌去利用戊糖废液产乳酸。此菌是在厌氧、 高温下进行发酵,减少了发酵罐的搅拌能耗及冷凝水用量从而节约生产成本，并且它可以同步利用葡萄糖和木糖，在木质纤维原料中含有木糖将弥补其在戊糖代谢中的不足，同时也对物质再生资源的有效利用有着重要意义，既环保又节约。
（1）建立实验必须的分析方法。
（2）进行响应面设计优化确定最佳培养基组分
4. 研究创新点
通过进行上述实验的研究，提高嗜热凝结芽孢杆菌利用木糖的发酵性能，进一步提高乳酸产量，并将其应用在以后的含戊糖废液发酵乳酸工艺上奠定基础。
