1. 研究目的与意义
了解果胶酶的制备和应用的现状，熟悉里氏木霉的微生物学和酶合成特性，掌握果胶酶活力测定、摇瓶发酵产酶、酶蛋白电泳分析和高效液相色谱产物测定的实验方法。通过本课题的研究能够初步建立里氏木霉产果胶酶的技术工艺。果胶酶是分解果胶质酶类的总称，在当前生物工程领域中起着非常重要的作用，不仅可用于食品工业如水果加工及葡萄酒生产等方面，还广泛应用于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理和饲料等行业中，另外果胶酶降解果胶而得到的果胶分解物对食品有很强的抗菌作用，特别是对大肠杆菌有显著的抑制增殖作用。
2. 国内外研究现状分析
果胶酶是分解果胶质的一类复合酶。按其作用机理分为果胶解聚酶和果胶醋酶两大类，它普遍存在于植物果实和微生物中。随来源不同，其种类和组分有所不同，酶学性质和作用方式亦有差异。国内在果胶酶方面的研究始于20世纪60年代，一般停留在菌种筛选及酶学特性的研究阶段。国外对果胶酶的研究始于1848年，对果胶酶各个组分的作用机制、基因的表达调控、组成型菌种的选育等方面均有相当深入的研究。20世纪90年代中期，果胶分解物作为天然防腐剂开发成功。1999年诺维信公司更是推出了用基因工程改造菌种生产的品牌为bipoerp的碱性果胶酶，垄断了中国碱性果胶酶市场。果胶酶生产占地面积约10%的整体制造的酶制剂。这些酶是广泛应用于食品工业生产果汁,水果饮料及葡萄酒。果胶酶生产菌株是黑曲霉cp-85211菌种。该菌种是中国科学院微生物研究所用亚硝基胍处理原生产菌株黑曲霉cp831获得的高产果胶酶突变株。采用该菌株发酵,发酵液再经过过滤、浓缩和有机溶剂沉淀等工序精制而成的粉状产品，主要应用于食品工业,特别适用于葡萄、苹果、草莓、山楂、沙棘、猕猴桃、菠萝、刺梨。为了促进果品资源和亚麻资源的开发利用,我国科研人员进行了果胶酶制备和应用的研究工作。以炭黑曲霉为出发菌株,经用化学方法和物理方法诱变筛选,获得了一株果胶酶高产的突变株g5512。食品工业的不断发展,使得果胶酶的用量不断增加。国外曾采用诱变处理方法提高菌种的产酶能力lll,国内研究人员以果胶酶生产菌黑曲霉(a,porgills,iger)cp一831为出发菌种,用亚硝基孤诱变处理,选育出一株高产果胶酶的菌株。应用于食品加工的商用果胶酶 ,起主要作用的是内切聚半乳糖醛酸酶 (ＥＣ3 .2 .1 .1 5 ) ,这种酶能水解果胶酸和聚半乳糖醛酸 ,产物是单乳糖醛酸、双乳糖醛酸和寡聚乳糖醛酸。
压榨富含果胶水果导致高粘度汁并保持与果肉在凝胶状的结构,阻碍汁提取工艺按。果胶酶除了在提取工艺的提高果汁产量通过一个更简单的过程,降低了汁粘度和降解,从而改善了凝胶结构汁集中能力。如果汁,酶法提取皮可以增加产量超过90%比常规机械高效工作,除了提高感官(颜色、香气、风味)营养(维生素)的属性和技术效率(缓解的过滤)。在一些过程聚半乳糖醛酸酶是应用伴随著其他细胞壁降解酶等纤维素和半纤维素。果胶酶的混合和纤维素酶被报道来改进超过100%汁提取产量。索尔斯和同事报道说改善三到四次汁的产量木瓜、香蕉和梨子使用酶提取而不是传统的紧迫的过程。能帮助减少酶治疗62 %苹果汁粘度。当果胶化苹果汁超滤,远高于蒸馏通量的时候非果胶化汁是处理。每次的增加由于meation率降低双方苹果汁粘度、减少总果胶内容。果胶是一个纤维状胶体受到污染会导致严重超滤 [80]. 商业上可用的果胶酶制剂使用在食品加工传统的聚半乳糖醛酸酶,果胶裂解酯酶甲酯和果胶。这些准备通常来源于真菌曲霉菌属为主[3, 10]。
果胶生产目前在我国尚处于起步阶段，主要原因是传统的用酒精沉淀的生产方法成本过高，而低成本的盐析方法在技术上还不成熟。立足于这一现状，以榨汁干燥后的苹果渣为研究材料，采用酸解盐析法对苹果渣中果胶的提取工艺及纯化技术进行研究，主要包括萃取剂的选择、提取果胶最佳工艺参数的确定、脱色方法的比较、糖和蛋白质脱除方法的初步尝试、盐析法沉淀果胶工艺参数确定、脱盐条件等。研究结果表明： ①试验所用的果渣提取果胶，选用h_3po_4和h_2so_3混合酸(1：2)作为萃取剂调节溶液的ph值，所得粗果胶无论是产率还是色泽都优于其它酸萃取的效果。 ②以630nm吸光度作为果胶溶液色度的指标；采用咔唑硫酸比色法，在530nm时测定果胶液的吸光度计算溶液中果胶得率。 ③酸解法提取果胶的最佳工艺参数为：温度95℃、ph 2.0、时间2.0h、料液比1：12；在此条件下测得粗果胶的提取率为14.62％。 ④用树脂脱色比用活性炭脱色效果好，所得产品无论得率还是质量都优于活性炭脱色。
3. 研究的基本内容与计划
研究内容：（1）不同来源底物诱导作用的比较；（2）液体发酵工艺参数的优化；（3）里氏木霉果胶酶系的酶学分析；（4）里氏木霉产果胶酶的实际应用。
计划：以里氏木霉为生产菌株，制定适宜的实验方案，评估和研究里氏木霉液体深层发酵生产果胶酶的发酵技术和工艺参数，如诱导物种类、初始底物浓度、氮源种类、添料方式和发酵时间等，初步建立果胶酶制备的最适液体发酵工艺条件。进入实验室第1、2周比较不同来源底物诱导作用，3、4、5周优化液体发酵工艺参数，6、7周进行里氏木霉果胶酶系酶学分析，8、9周探讨里氏木霉产果胶酶的实际应用。
4. 研究创新点
目前研究多以黑曲霉为生产菌株，本实验以里氏木霉为生产菌株，评估和研究里氏木霉液体深层发酵生产果胶酶的发酵技术和工艺参数，如诱导物种类、初始底物浓度、氮源种类、添料方式和发酵时间等，初步建立果胶酶制备的最适液体发酵工艺条件，准确、快速测定酶活力是进行酶固定化的前提，在摸索中改进方法，另外开发活力高、稳定性好、专一性强的果胶酶制剂是对果胶酶研究的必然要求。面对国外果胶酶产品的优势，必须利用我国丰富的微生物资源，加紧筛选出能适合实际生产需要的菌种。
