1. 研究目的与意义
1、研究的目的及意义
1.1研究目的
β-半乳糖苷酶广泛存在于微生物、植物及哺乳动物的肠道中，能水解乳糖中的β-1,4-糖苷键，使其生成葡萄糖和半乳糖。β-半乳糖苷酶广泛应用于乳制品行业，在液态奶类和乳制品加工过程中，加入β-半乳糖苷酶，使其消化为葡萄糖和半乳糖，相应的产品被称作低乳糖液态奶和低乳糖乳制品。其中凝结芽孢杆菌nl01β-半乳糖苷酶是一种能快速有效水解乳糖中β-1,4-糖苷键的酶，并且作为一种耐热的β-半乳糖苷酶，它不仅能够有效降低生产工艺中微生物污染的风险，也能够提高反应速度，在乳品生产工艺中有显著优势[1]。
2. 国内外研究现状分析
2、文献综述
2.1研究背景
随着基因工程的发展,微生物表面展示系统已发展出噬菌体展示系统、细菌表面展示系统、酵母表面展示系统等，广泛应用在生物学研究及工业生产的许多领域，例如研究蛋白质-蛋白质之间的相互识别与相互作用、由多肽构象或蛋白质突变库中获取特定功能蛋白、生产抗体、生产口服疫苗、开发全细胞催化剂、开发生物传感器、开发细胞吸附剂等等,成为竞相研究的热点[4]。 但已发展的微生物表面展示系统都存在自身明显的缺陷:噬菌体展示系统展示的多肽或蛋白分子量不能太大，否则会影响噬菌体的装配与感染；革兰氏阴性菌表面展示系统表达的重组蛋白易以包涵体形式存在,展示的蛋白不仅要通过质膜层，还要在外膜上正确的整合，这可能对展示蛋白的结构和活性产生影响；革兰氏阳性菌细胞壁厚,转化效率较低，这样会影响大容量肽库的构建；两种细菌表面展示系统均缺乏翻译后修饰功能，容易使展示的真核蛋白失活；酿酒酵母中虽存在蛋白质翻译后修饰，但糖基化方式与哺乳动物不同,它对外源蛋白n-糖基化修饰形式是高甘露糖型,糖链平均为50-150甘露糖残基，并且核心寡糖末端是α-1,3-甘露糖，从而使生产的蛋白在人体中有比较强的免疫原性，过度糖基化还可能使表达的酶等功能性蛋白失活。毕赤酵母(pict pastors)表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。其具有易于培养、繁殖快、具有乙醇氧化酶基因诱导型强启动子，可调控外源基因的表达、可对外源蛋白进行更接近高等生物的加工折叠和翻译后修饰、便于基因工程操作和高密度发酵等的特性，成为微生物表面展示系统极有应用前景的宿主菌。目前已有的毕赤酵母表面展示系统主要是利用来自酿酒酵母flo1蛋白的n端絮凝结构域为锚定蛋白将外源蛋白展示于菌体表面，融合蛋白非共价连接于毕赤酵母细胞壁上。展示的外源蛋白通过n端与锚定蛋白融合，c端蛋白游离，这样的系统适合脂酶等活性位点在c端的功能蛋白。但对活性位点在n端的功能蛋白表达不利，限制了更广泛的应用。为丰富毕赤酵母展示系统，展示不同需要的外源蛋白[5]。
3. 研究的基本内容与计划
3、研究内容及计划
研究内容：
1.建立实验必需的分析方法,利用hplc同时测定乳糖、半乳糖、葡萄糖以及乙醇；β-半乳糖苷酶酶活测定。
4. 研究创新点
4、特色与创新
本实验采用HPLC(高效液相色谱) 同时测定乳糖、半乳糖、葡萄糖以及乙醇含量；对由本实验室构建的E. coli BL21 (pETDuet-gal) 进行诱导表达，镍柱纯化以获取β-半乳糖苷酶纯酶，用oNPG法测定酶活；分别进行低底物浓度时的单糖与混糖发酵，分析发酵历程中各物质含量变化，分析糖利用规律探索乳清粉中乳糖酶解的最适酶用量，最适酶解pH，以及底物浓度对酶解的影响。通过分批补料同步糖化发酵乳清粉，比较接种量、发酵pH、底物浓度几发酵方式等对乳清粉发酵的影响，最终找出乙醇产量最高的条件。
