1. 研究目的与意义
原发性乳糖酶缺乏症是迄今影响最大的全球性营养代谢障碍之一，如何有效解决乳糖酶缺乏症是国内外学者长期致力研究的课题。德氏乳杆菌保加利亚亚种属于乳杆菌属热乳酸杆菌亚种，其β-半乳糖苷酶能迅速分解乳糖，是乳酸菌源β-半乳糖苷酶中酶活性较高的一种。鉴于德氏乳杆菌保加利亚亚种具有高产β-半乳糖苷酶的特性和食用安全性，我们将其作为基因初始菌。本研究在大肠杆菌中非融合表达了德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶，为构建能高效表达β-半乳糖苷酶的食品级益生菌株奠定了基础[1]。
β-半乳糖苷酶能够催化β-半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷键发生水解[2]，还具有转半乳糖苷的作用。对此酶的最初应用是利用其水解乳糖的性质来降低乳制品的乳糖含量。这样既可以解决乳糖不耐症患者的乳品消费问题[3]，又可以提高乳制品的甜度，减少甜味剂的用量，而且不增加食品的热量。随着生物技术的发展，可获取具有一定优良特性更高酶活的β-半乳糖苷酶，并对编码此酶的基因结构有了相当了解，探讨了其反应作用机制，使得β-半乳糖苷酶不仅在食品工业中的用途越来越广泛，而且在生物技术领域如基因工程、酶工程、蛋白质工程方面都发挥着重要作用，并广泛应用于化学、医药等领域。近20年来基因工程、酶工程、蛋白工程的迅猛发展，对编码此酶的基因及其表达调控在分子水平上做了大量深入研究，如重组基因、融合蛋白等，反过来也促进了生物技术诸多领域的发展。
2. 国内外研究现状分析
2.1β-半乳糖苷酶概述
β-半乳糖苷酶(ec.3.2.1.23)又称乳糖酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，它能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖。某些种类的β-半乳糖苷酶由于其构型保持型作用机制，在水解乳糖分子中β-1,4-半乳糖苷键的同时，具有转半乳糖基作用，以乳糖或其水解产物半乳糖和葡萄糖为糖基受体，合成半乳糖苷键，生成低聚半乳糖。不同微生物来源的β-半乳糖苷酶的水解活性和半乳糖基转移活性的比例不同。某些微生物，如kluyveromyceslactis，k.fragilis，aspergillusniger等所产生的β-半乳糖苷酶具有较强的水解活性；而某些微生物，如lactobacillusbulgaricus，streptococcusthermophilus，aspergillusoryzae，bacilluscirculans，bifidobacteriumspp.等所产生的β-半乳糖苷酶则具有较强的半乳糖基转移活性[4]。2.2β-半乳糖苷酶的研究概况
β-半乳糖苷酶因广泛存在于大肠杆菌、肺炎杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热脂肪杆菌[7]中，由于其可以人为地分为两部分，当两者彼此分离时都没有β-gala基因的活性；而当两者结合时便表现出β-半乳糖苷酶基因的活性，鉴于此种特性β-半乳糖苷酶基因常在分子生物学中用于外源基因的插入，连接以及转化，表达的检测，即蓝白斑筛选。蓝-白斑筛选实验业已被应用多年，而且沿用至今乳糖酶，学名β－半乳糖苷半乳糖水解酶，又名β-半乳糖苷（β-galactosidaseec3.2.1.23）。是一种白色粉末，无味无嗅，溶解后是一种浅棕色液体。乳糖酶通过特定条件水解半乳糖苷键，将乳糖水解成易被肠道吸收的葡萄糖和半乳糖。1889年荷兰生物学家beijerincek第一次报道了乳糖酶可水解乳糖。乳糖水解牛奶不仅能有效地改善乳糖吸收不良，还能大大减轻症状。国外学者经多年研究，已成功地找到产乳糖酶的微生物，并研制了一系列乳糖酶商品。而我国在这方面起步比较晚，迄今为止，我国绝大多数乳糖酶仍是依赖进口。因此，研究开发乳糖酶产品，特别是高产高效优质乳糖酶产品并使其实现产业化具有重要意义。目前，基因工程技术在β-半乳糖苷酶研究中也发挥了重要的作用。将交替单胞菌类（pseudoalteromonasspp.）的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌体内表达，经分离提纯得到的嗜冷性β-半乳糖苷酶可以在30c条件下于28h内水解牛奶中90%的乳糖。这一重组酶的优点在于它甚至能在15c条件下于28h内将牛奶的90%的乳糖水解完。由保加利亚乳杆菌（l.acidophilus）[5]的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌体内表达所分泌的重组嗜冷性β-半乳糖苷酶可在10c条件下于30h内可水解牛奶73%的乳糖。研究人员对由保加利亚乳杆atcc11842的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌体内分泌的耐酸性β-半乳糖酶的应用条件进行了研究，发现该酶最适温度为35-50c，最适ph值为5.0-5.5。由上可见，β-半乳糖苷酶研究趋势表现为结合基因工程开发在极性环境下（如低温、高酸）仍能表现较高的乳糖水解活性的乳糖酶。如，在生产低乳糖牛奶时，耐热性β-半乳糖苷酶在巴氏杀菌过程中水解乳糖就具有很大的优势。而这一切的基础在于能够找到表达β-半乳糖苷酶的优良基因携带者[6]。
3. 研究的基本内容与计划
保加利亚乳杆菌是酸奶发酵剂中应用较早的菌种，近年来，许多学者对其抗冻性、抗氧化性和微量元素富集等方面进行研究并取得了新的进展[14]。
不同乳酸菌β-半乳糖苷酶的活性具有显著的差异，多数乳酸菌在ph2.0
时其耐受性较弱，而ph3.0时耐受性较强，其中，保加利亚乳杆菌在ph3.0时甚至有增殖的趋势。保加利亚乳杆菌具有良好的定植作用，具有作为益生菌用于食品加工的潜力[15]。
4. 研究创新点
本实验运用基因工程，以保加利亚乳杆菌为模板，通过基因工程手段和培养条件优化使酶活提高，使β-半乳糖苷酶的工业化生产成为可能，为低聚乳糖制品的开发与利用提供新的思路。
