1. 研究目的与意义
l-苯丙氨酸(l-phe)是人和动物体内不能合成的8种氨基酸之一,人们称其为必须氨基酸。l-phe在生物体内是转化成l-酪氨酸的原料,因而l-phe成为一些氨基酸输液和氨基酸饮膳所必须的成分。而且,l-phe是合成药物麦角胺、抗生物质和维生素b6的重要原料。同时,l-phe也是合成一些抗癌药物的中间体[1]。在食品工业中,l-phe最主要的用途是合成二肽甜味剂,俗称蛋白糖。基于l-phe广泛的应用前景,近年来l-phe成为氨基酸行业单品中产量增长最快的一种。为此，要研究出更加优良的工艺来制备苯丙氨酸。
以苯丙酮酸或肉桂酸为原料用生物法生产苯丙氨酸的主要方法有如下几种：①中国科学院成都生物研究所开发的肉桂酸解氨酶法；②南京化工大学开发的海因（己内酰脲）酶法；③华东理工大学用遗传育种得到的菌株发酵法生产技术；④复旦大学采用诱变育种和基因工程技术相结合的方法选育高产菌种生产技术。
l-苯丙氨酸在自然界中存在很广，在人体中主要存在于纤维蛋白、血红蛋白中，影响甲状腺激素和毛发、皮肤的黑色素的分泌，阻碍与膀胱功能的衰退。d-苯丙氨酸在自然界中并不存在，需人工合成,近些年随着人们对d-苯丙氨酸认识的加深，其应用范围也变得越来越广泛，比如用于抗肿瘤药物及治疗糖尿病药物的合成。
2. 国内外研究现状分析
1.苯丙氨酸的发现
1879年Schulze从羽扇豆幼苗及椰子中发现和分离出了一种新的氨基酸，他经过推断认为其分子结构为苯基氨基丙酸；到1882年，Erlenmeyer和Lipp成功的合成出了苯基-α-氨基丙酸，并将其命名为苯丙氨酸；到1885年，Schulze经过研究确证了他从豆类中提取的氨基酸和Erlenmeyer等人合成的苯丙氨酸是同一种物质，从而被认为是一个发现苯丙氨酸的人。到了20世纪初Fischer也从动物蛋白-酪蛋白中成功地得到它[2]。
2. L-苯丙氨酸的现状与发展前景
中国的L-苯丙氨酸生产始于1994年，主要采用胧氨酸母液提取法工艺，产量很低。1996年，中国科学院成都生物研究所开始研究肉桂酸解氨酶发酵法生产L-苯丙氨酸技术，并实现了工业化生产。2000年4月，南昌化工（集团）有限责任公司与南京化工大学合作，实现了100t/a海因酶法L-苯丙氨酸的正常化生产。安徽科苑集团也成功开发了固体化酶法生产L-苯丙氨酸技术，其400t/aL-苯丙氨酸项目被列为1999年度国家级火炬项目。到2001年，我国发酵法生产企业有15家，总生产能力为2120t/a。表1列出了中国发酵法生产L-苯丙氨酸企业情况。
表1 中国发酵法产L-苯丙氨酸企业情况 t/a
企业名称 | 生产工艺 | 生产能力 |
浙江亚美生物化工股份有限公司 | 肉桂酸解氨酶法 | 300 |
南昌化工〔集团〕有限责任公司 | 海因酶法 | 300 |
安徽科苑（集团）股份有限公司 | 固体化酶法 | 400 |
平顶山易元制药有限公司 | 直接发酵法 | 100 |
新疆伊宁复祥生化公司 | 直接发酵法 | 100 |
宁波市镇海恒基氨基酸厂 | 发酵法 | 100 |
江苏武进市牛塘化工厂 | 发酵法 | 100 |
连云港市味源酿造有限公司 | 红酵母发酵法 | 100 |
上海味之素氨基酸有限公司 | 发酵法 | 100 |
河北冀荣氨基酸有限公司 | 发酵法 | 120 |
天津市津北生物化学制药厂 | 发酵法 | 100 |
浙江天新医药化工有限公司 | 发酵法 | 100 |
湖北峰江氨基酸有限公司 | 发酵法 | 100 |
四川峨眉山荣高生化制品有限公司 | 发酵法 | 100 |
合计 | 2120 |
由于进口产品和L-苯丙氨酸下游产品使用者习惯的影响，我国L-苯丙氨酸的装置开工率不足，2000年的实际生产量仅为500～600t，而进口量约700t。
3. L-Phe的生产方法
需求的不断增长，L-Phe的生产受到越来越多的关注。L-Phe主要由化学合成法、酶法和微生物发酵法等3种方法来生产[4]。化学合成法因其生产路线长、副产物多、且产物为消旋体不宜推广使用[5]。酶法主要是由化学合成的类氨基酸前体经过微生物细胞内酶系高效专一地催化合成L-Phe[6]。酶法生产工艺简单、产物浓度较高、纯化步骤简便且生产能力较强，是目前工业化生产L-Phe的主要方法之一。Anzawa等[7]利用弗氏柠檬酸杆菌的转氨酶催化PPA生成L-Phe，当以L-谷氨酸为氨基供体时，反应1h，L-Phe的浓度可达到30 g/L，反应24 h，达到89 g/L，转化率为50-80%。徐虹等[8]通过两菌双酶法，耦合E. coli EP8-10中的转氨酶和E. coli EA-1中的天冬氨酸酶作用，由PPA和富马酸 (Fu) 生成L-Phe，耦合体系在EA-1和EP8-10两种细胞质量比为0.4：1，PPA：Fu = 1：1.2 (mol/mol) 时，反应6 h可使0.24 mol/L的PPA转化为38.5 g/L L-Phe，摩尔转化率达到97%。然而，近年来，由于底物和酶等主要原料成本高、来源有限，反应过程中酶稳定性差等缺点，酶法生产L-Phe也受到了很大制约。发酵法是指利用微生物由碳源和氮源大量生产L-Phe的一种方法，具有原料廉价易得、环境污染较小、产物纯度高等优点[9，10，11]。20世纪60年代，日本中山公司用糖发酵制备L-Phe获得了成功，并由协和发酵公司实现了工业化生产。随着代谢工程、发酵工程等相关技术的不断发展，发酵法生产L-Phe受到国内外研究者的关注并得到了广泛深入的研究，成为目前国内外工业化生产L-Phe的主要方法。
4.L-Phe 合成的代谢调控策略
4.1在解除反馈调节的基础上提高关键酶的表达
在野生型菌株中，代谢物质的合成遵循细胞经济学原理。在正常条件下，只有少量的中心代谢物转化为L-Phe。理论上，L-Phe的过量合成可通过关键酶基因的克隆和过量表达以增加酶的表达量来实现。然而，由于L-Phe等终产物对其合成代谢途径的关键酶的酶活和/或酶的表达量具有强烈的反馈抑制和/或反馈阻遏作用，使L-Phe的过量积累受到限制。在弱化反馈调节的基础上过量表达关键酶的基因，可以解除L-Phe过量合成的限制因素，有望提高微生物合成L-Phe的能力。基于这一目的，抗反馈调节(Feedback-resistant, fbr) 关键酶的筛选和其在发酵法生产L-Phe的应用中得到了广泛并深入的研究，大大促进了微生物发酵法生产L-Phe的工业化进程。
4.2降低副产物或分支代谢产物的合成
副产物或分支代谢产物的生成不仅造成碳源的浪费，降低L-Phe对碳源的得率，对发酵后的提取工作带来一定的负担，而且对生产菌株产生抑制作用，影响其生长和生产L-Phe的能力。因此，副产物或分支代谢产物的降低或消除对促进L-Phe的发酵生产具有重要的作用。
在使用葡萄糖为碳源的培养基中，副产物乙酸往往伴随着菌体的快速生长和溶氧不足而产生。当乙酸的浓度超过1.5 g/L时菌体生长将受到抑制[12]。使用透析或者通过细胞循环的方法可以减少发酵液中乙酸的浓度，减轻对细胞的毒害作用[13]，但并不能从根本上解决碳源的流失问题。
4.3提高前体物质的供应量
目前报道的L-Phe最高产量为50 g/L，对葡萄糖的得率系数则只有20-25% (g/g)，远远低于L-赖氨酸和丙氨酸等其它氨基酸[16,17]。在芳香族氨基酸合成途径中，PEP和E4P是两个重要的限制性底物，它们的供应量决定着中心代谢流的碳源能否有效地导向DAHP的合成，从而为芳香族氨基酸的合成提供充足的前体物质[18]。
5.PH对大肠杆菌制备苯丙氨酸的影响
苯氨酸解氨酶 ( Phenylalanine Ammonia lyase,PAL, EC4.3.1.5) 可以催化反式肉桂酸转化生产 L- 苯丙氨酸, L- 苯丙氨酸工业生产所用的 PAL 酶主要来自红酵母属[19], 生产方法主要有发酵法和酶法, 随着底物肉桂酸生产成本的降低, 利用苯丙氨酸解氨酶合成 L- 苯丙氨酸的方法呈现出较大的竞争优势。但在生产过程中, 由于红酵母 PAL 产量低, 酶活迅速下降, 极大地限制了 L- 苯丙氨酸的生产。为了提高 PAL 酶活, 一些学者试图用苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌高效表达合成PAL[20-22]。尽管 PAL 在大肠杆菌中得到表达, 但重组大肠杆菌培养过程中培养条件对菌体生长以及产物表达的影响却少见报道。有研究表明, 培养过程中 pH 对重组大肠杆菌的生长以及产物的表达有很大影响, 不同重组大肠杆菌的最佳生长与产物表达 pH不同。邹祥等[23]发现 pH 对产 L- 胡萝卜素重组大肠杆菌生长和产物的表达有显著影响, 他们发现, 当发酵 pH 为 6.0 时, 细胞干重和 β- 胡萝卜素的表达量均处于较高的水平, 而当发酵体系呈碱性和强酸环境, 细胞生长速率和产物合成速率下降较快, 明显不利于细胞生长和产物表达。曹宜生等[24]研究了三种不同 pH 的培养基对大肠杆菌表达 rhGM- CSF 产率的影响, 结果发现, pH 为 7.0 的培养基最好, 比 pH 为 6.7 的培养基所得的菌体得率和表达量提高50 %, 与 pH 7.3 培养基的菌体得率相似, 但表达率提高 1 倍多。以上研究表明, pH 对重组大肠杆菌生长及产物生成有显著影响。因此, 本文主要研究培养过程中发酵液 pH 对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌生长以及产酶的影响, 以获得最佳的生长及产酶 pH。
6. 副产物抑制对大肠杆菌制备苯丙氨酸的影响
在大肠杆菌中, 80%的3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮-7-磷酸(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate, DAHP)合酶由aroG基因编码。分别以大肠杆菌K12及其抗苯丙氨酸类似物的突变体总DNA为模板, 以PCR方法扩增得到aroG基因及其突变体。 基因测序结果表明抗苯丙氨酸类似物的突变体, 其aroG基因核苷酸625位发生了T→C的点突变, 从而使AroG蛋白的209位氨基酸由Ser取代了Phe。 aroG基因及其突变体克隆到表达质粒pTrc99A上, 在大肠杆菌JM105中进行表达, 表达产物的SDS-PAGE上可以看到分子量相当明显的条带； 菌体粗提物中DAHP合酶的活性提高了1.8倍； 酶活抗性检测表明AroG蛋白突变体在一定程度上解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用； 与含K12 aroG基因的JM105细胞相比, 含aroG基因突变体的JM105细胞可以在含高浓度苯丙氨酸类似物的培养基上生长[14]。
3. 研究的基本内容与计划
1.研究内容
利用基因工程重组菌发酵制备苯丙氨酸的工艺初探,主体研究温度对大肠杆菌制备苯丙氨酸的影响。
2.计划
4. 研究创新点
菌株来说，关键酶的表达和稳定性对于温度的要求十分严格。若表达载体为温度诱导型质粒，温度不仅是发酵条件之一，还扮演着诱导剂的角色，因此合理的温度控制方法或策略对于L-Phe的发酵十分重要。1994年，Lee 等[15]在构建了一个温度诱导型表达系统的基础上，对重组E. coli发酵生产L-Phe过程中的温度进行了进一步的优化和控制，总结出30-32℃更有利于L-Phe的合成。不同的生产菌株和不同代谢产物对于温度的要求也不一样。所以设计发酵的不同阶段进行诱导，从而比较不同的实验结果，找出最适合的诱导时间。
