1. 研究目的与意义
胆汁酸（Totalbileacids,TBA）是胆固醇在肝中降解的代谢产物，是胆汁的重要成分，有助于脂质在肠道的消化吸收。从来源上可分为初级胆汁酸和次级胆汁酸，是一类24碳胆烷酸的总称，其共同结构特点是3α位上都有一个羟基。胆汁酸在脂肪代谢中起着重要作用，胆汁酸主要存在于肠肝循环系统并通过再循环起一定的保护作用。只有一少部分胆汁酸进入外围循环，促进胆汁酸肠肝循环的动力是肝细胞的转运系统-吸收胆汁酸并将其分泌入胆汁、缩胆囊素诱导的胆囊收缩、小肠的推进蠕动，回肠黏膜的主动运输及血液向门静脉的流入。当肝功能损伤或肠肝循环发生障碍时，血中TBA浓度升高。血清TBA检测是敏感的肝功能指标之一，已成为肝功能试验的常规项目。但胆汁酸在正常血清中的浓度很低（μmol/L水平）不易检测，这就要求检测方法的灵敏度要高。
3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteroiddehydrogenase,3α-HSD）是睾酮丛毛单胞菌分泌的一种类固醇脱氢酶，由258个氨基酸残基构成理论分子量为26.4kDa。3α-HSD可作用于多种类固醇基质，可逆地催化C19～27类固醇3位羟基/酮基的氧化还原[1]。胆汁酸是3α-HSD的作用底物之一，临床上用3α-HSD作为工具酶来测定人血清中的总胆汁酸浓度。
2. 国内外研究现状分析
自从70年代由睾酮丛毛单胞菌中提取到高纯度3α-HSD后，TBA酶法测定逐步发展起来。目前TBA检测多用第四代的酶循环法，通过脱氢酶辅酶体系循环底物，将微量的胆汁酸放大，提高了反应的灵敏度[2]。3α-HSD在原核生物中广泛分布，国外已经从睾酮假类单胞杆菌中克隆出3α-HSD基因[3,4]。我国自上世纪80年代末开始应用酶循环法测定血清TBA浓度，这十几年来所用试剂均从国外进口、价格昂贵。因此，试剂的国产化长期以来备受关注。要解决试剂的国产化，关键是解决工具酶的问题。目前TBA测定中所用的工具酶3α-HSD均从睾酮丛毛单胞菌中直接提取而来。天然3α-HSD提取工艺复杂，需经过多步层析和制备性等电聚焦电泳技术来纯化,步骤繁琐，纯化过程中伴有酶活性的丢失，酶蛋白的得率低[5]。使得天然3α-HSD价格昂贵，在一定程度上限制了TBA测定的临床推广。分子生物学技术的进步，极大地推动了蛋白质生物合成的发展。Mobus等已在大肠杆菌中成功表达了融合3α-HSD，但未对其性质作深入研究，也没有将融合酶蛋白作为工具酶，应用到临床实践中[6,7]。
3. 研究的基本内容与计划
实验步骤
1.3α-hsd质粒抽取
2.3α-hsd的转化
4. 研究创新点
本实验以质粒pET-15b为载体构建3α-HSD的原核表达系统，经IPTG诱导后得到了具有酶活性的融合蛋白，总蛋白进行凝胶电泳（SDS-PAGE）分析并测定酶活性。利用重组蛋白中的6个组氨酸（His）组成的标签进行亲和层析，经一步金属螯合亲和层析纯化后，重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出均一的一条带，回收率达90%。脱盐并以雄酮为底物以NAD＋和thio-NAD＋分别为辅因子，测量其蛋白活性[8]。活性和纯度均较高的目的蛋白3α-HSD的获得，为血清总胆汁酸酶循环法测定奠定了基础[9]。
