氧化丝蛋白溶液自组装动力学研究开题报告

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1. 研究目的与意义

蚕丝蛋白是一种广泛存在的天然结构蛋白，其主要组成为甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸这三种较为惰性氨基酸。丝蛋白溶液在一定浓度的乙醇诱导下会组装成纳米纤维结构,其形成过程与分子中β-折叠结构含量直接相关。由此，本课题的主要目的是探究醇诱导下氧化丝蛋白的装过程。通过本课题的研究，可以为丝素蛋白的自组装功能性材料提供理论基础

2. 国内外研究现状分析

2.1蚕丝蛋白的结构与构象

蚕丝是由丝素蛋白(Fibroin)和丝胶(Sericin)两部分组成,丝胶包在丝素蛋白的外部,在柞蚕中约占重量的10%,桑蚕中约占20%，蚕丝中还有5%左右的杂质, 丝素蛋白是蚕丝中主要的组成部分,在柞蚕中约占重量的85%，桑蚕中约占75%。丝素蛋白以反平行折叠链构象为基础,形成直径大约为10nm的微纤维,无数微纤维密切结合组成直径大约为1Lm的细纤维,大约100根细纤维沿长轴排列构成直径大约为10Lm～18Lm的单纤维,即蚕丝蛋白纤维。

图1 蚕丝蛋白纤维

丝素蛋白的聚集态结构被认为由结晶态和无定形态两大部分组成，结晶度在50%～60%左右，曾提出了一种嵌段分子模型。通过偏振拉曼(Raman)光谱首次发现蚕的前部丝腺内丝素蛋白以向列型液晶态形式存在，小角X散射(SAXS) 测得含有两种似棒状结构，其宽度方向尺寸大小均为3194nm，长度方向尺寸分别为6102nm和710nm。

人们以生丝以及再生丝素蛋白水溶液为对象,采用多种不同方法,研究了丝素蛋白纤维的构象，生丝中分子链的构象为不溶于水的少β-折叠,丝素蛋白在水溶液中当浓度很低时呈无规线团,但浓度超过5%后,溶液中出现α-螺旋构象，其含量随浓度增加而迅速增加。目前被报道的再生丝蛋白规整聚集形态主要有3种：类Ⅱ型β-转角结构（SilkⅠ）、反平行β-折叠构象（SilkⅡ）和左手聚甘氨酸Ⅱ型结构（SilkⅢ）。在稀溶液中的丝蛋白主要以无规线团的构象存在，但在热力学上β-折叠才是丝蛋白分子链最稳定的构象。因此，在一定的外界条件下（如温度、PH值的变化、溶剂、金属离子作用及搅拌剪切等应力作用）可以很容易地诱导丝蛋白发生由无规线团向β-折叠的构象转变。

2.2 丝素蛋白的氨基酸序列

丝素蛋白中包含18种氨基酸，主要由甘氨酸，丙氨酸和丝氨酸等氨基酸组成，占总氨基酸组成的85%左右，三者的摩尔比约为4:3:1，酪氨酸含量仅次三者之后，约占10-12%。组成重链的12个结构域形成了蚕丝纤维的结晶区。是由于这些结晶区被无重复单元的主序列打散，所以纤维中只有少数有序的结构域。纤维中的结晶结构域由甘氨酸一x氨基酸的重复单元组成，x代表丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。在蚕丝纤维中，一个结晶结构域平均由381个氨基酸残基组成。每个结构域又包含多个六缩氨酸组成的次结构域。这些六缩氨酸包括GAGAGS，GAGAGY，GAGAGA或GAGYGA(G是甘氨酸，A是丙氨酸，S是丝氨酸，Y是酪氨酸)这些次级结构域以四缩氨酸结尾，比如GAAS或GAGS。丝素重链里较少结晶形成的区域，也被称为连接区，长度在42～44个氨基酸残基之间所有的连接区都有一个完全相同的25个氨基酸残基(非重复序列)，这些氨基酸残基由结晶区所没有的带电荷的氨基酸组成。（其具体氨基酸构成见下表1）

表1丝素蛋白的氨基酸构成

桑蚕丝素H链的核心区域主要由Gly-X序列构成，X序列主要是丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸，其含量占重复序列的比例分别是65%、23%、9%，其分子质量约为350kDa。柞蚕丝素中酸性氨基酸和碱性氨基酸残基的含量较高，同时柞蚕丝素蛋白中含有大量带有极性和侧基可电离的氨基酸残基，这些都是化学反应的潜在反应点，因此柞蚕丝素的化学活性较强。

2.3 蚕丝蛋白的性质

蚕丝蛋白无毒、无害、无刺激性，它具有独特的分子结构、优良的机械性能、化学性能、极好的吸湿保湿性和抗微生物的性能。从工业用材料的角度来看，与其它天然生物聚合物相比，蚕丝蛋白材料均匀单纯，容易大量获得，在制备过程中无需添加有害助剂，并且能够很容易通过干燥、加热、压缩、化学药品处理等方法，改变它的结构，能制成纤维、粉末、溶液、薄膜等多种形态，应用灵活。

丝素蛋白由于具有多孔性及较高的吸水回潮率, 因此透气性好、光滑柔软、手感好、穿着舒适。从40年代起, 人们发现其从175℃开始逐步失重, 颜色由白变黄,至280℃完全变黑。Schw enker、石川博等用DSC 研究,发现在100℃附近蚕丝开始脱水, 305℃时观察到样品分解。对于无定形态的丝素蛋白膜,它的玻璃化转变出现在173℃, 当温度超过180℃以后,无规线团向B-结构转变。

蚕丝素蛋白的力学性能随其存在的形式不同而不同,以纤维形式存在时力学性能较好,通过对生丝在拉伸过程中的表面形貌及断口的观察提出了断裂过程的几种模型。作者发现丝素蛋白膜在干燥状态下和有机溶液体系中很脆。

丝素蛋白分子中因含有一定量的羟酚基及其它结构,容易吸收紫外光而变性, 对其性能有很大影响,随照射时间的增加,丝素蛋白泛黄程度也增加,特别是在有水存在下,泛黄更为严重。

2.4 丝素蛋白的制备方法

丝蛋白分子链在动物丝纤维内是由大量链间氢键而得以稳定，并且形成了规整、疏水且高含量的β-折叠区域，动物丝在水和大多数有机溶剂中仅能溶胀而不溶解。为制备纺丝原液及其他各种性状的丝蛋白基材料，将动物丝溶解以获取大量丝蛋白溶液成为了主要途径。在此过程中，溶剂的选择和溶解温度至关重要，它们既要有很强的氢键破坏能力以摧毁物理交联点，又必须尽可能少地影响肽键以避免分子链过度的降解。

2.4.1盐解法制备较高分子量丝素蛋白溶液

盐解法主要分为无机盐解法和有机盐解法。无机盐解法要称取一定量脱胶丝素纤维，置于质量浓度为50% 的氯化钙沸溶液中处理5 min左右，直至丝素纤维溶 解完全。其间用玻璃棒搅拌，获得丝素/氯化钙混合溶液。将上述混合溶液用纱布过滤进行粗提，再放入透析袋（8-14kda）中，用蒸馏水透析72 h左右，期间经常换水，以除去氯化钙离子，获得盐解丝素蛋白溶液。一般认为，在无机盐体系中，高浓度的金属盐离子将破坏氢键，丝蛋白的β-折叠结构被解开，分子链以无规线团的构象而处于溶解状态，由于大量盐离子的存在，丝蛋白的无机盐水溶液需要通过半透膜透析或者凝胶过柱的方式以得到几乎不含盐的再生丝蛋白水溶液。但是透析后得到的再生丝蛋白溶液浓度较低，仅为3%-4%，远不足以成为纺丝的原液（浓度约30%）。采用无机盐体系是获取丝蛋白水溶液的直接方法，且价格较为低廉，因此目前应用最为广泛。然而，它也存在一定的不足，一方面无机盐溶解丝蛋白后需要通过透析除去，且往往需要对溶液进一步的浓缩，整个过程较繁琐，并消耗大量的盐、水、人力和时间；另一方面，无机盐体系在溶解丝纤维的过程中将导致丝蛋白分子链的不同程度的降解。

有机盐解法是新发展出来的丝蛋白溶解体系，主要包括：N-甲基N-氧化吗啉（NMMO）和含卤离子的离子液体。与无机盐体系不同的是，再生丝蛋白能够直接在有机溶剂或水等沉淀剂中从其有机盐溶液析出，成为再生丝或各种形貌的再生丝蛋白材料，而有机盐则可以被回收并再次利用。

2.4.2 酶解法制备较中等分子量丝素蛋白溶液

按照方法盐解法制备一定量丝素蛋白溶液，加入一定量碱性蛋白酶，使酶重量为丝素蛋白溶液重量的 0.5%左右，用NaOH调整溶液pH=8.5。将溶液置于摇床中（46.2℃，80 r/min）振荡处理1 h后，在微波炉中高火处理30s，使蛋白酶失活，并用HCl中和处理。再将溶液用透析袋透析纯化，获得酶解丝素蛋白溶液。

2.4.3 碱解法制备较低分子量丝素蛋白溶液

称取一定量脱胶丝素纤维，加入到 4 mol/L NaOH溶液中，煮沸并在982 ℃条件下恒温处理1 h，为了防止水分蒸发而增加碱的浓度，期间不断补加热水。处理结束后，用4 mol/L HCl中和至pH=7。将中和液用滤纸过滤去除沉淀，再用透析袋透析纯化，获得碱解丝素蛋白溶液。

2.5 丝素蛋白的自组装

自组装（self‐assembly），是指基本结构单元（分子，纳米材料，微米或更大尺度的物质)自发形成有序结构的一种技术。在自组装的过程中，基本结构单元在基于非共价键的相互作用下自发的组织或聚集为一个稳定、具有一定规则几何外观的结构。

2.5.1自组装的方法

目前分子自组装的主要方法包括以下几种：基于化学吸附的自组装膜技术，于海峰等人利用化学吸附作用结合光辐射获得一种液晶显示用光定向材料；基于物理吸附的离子自组装膜技术，如Choi J U等用离子相互作用自组装了非线性光学发色团层状材料；旋涂方法，1994年Kim 等人用旋涂方法在玻璃底物上得到不对称聚联乙炔的自组装膜；慢蒸发溶剂法，Kunitake 和他的合作者首次通过缓慢蒸发水或非质子溶剂获得两亲分子自组装膜；枝接成膜法，若聚合物与溶剂不相容，憎溶剂相互作用使高分子链自组装成有序膜；基底上的有机分子组装，金属、金属氧化物、半导体及无机晶体均可作为基底材料；基于超分子识别的超分子合成等方法。

2.5.2 丝素蛋白自组装

家蚕丝素蛋白具有良好生物相容性，且原料来源丰富、提纯方便，易加工成型，将天然蚕丝溶解得到丝素溶液，经加工后可形成纤维／无纺网、薄膜、多孔海绵／凝胶等各种形态的材料。丝素蛋白是蚕丝最主要的组成部分，为一类无明显生理活性的纤维性结构蛋白质，被蚕用作结构性材料，适合从高分子材料角度进行研究。其结晶形态包括silk‐I 和silk‐II ，silk‐II为以氢键连接的反平行β-折叠结构，其分子链段间组装最为合理，能量处于最低状态，最稳定，因此 silk‐I极易转变成silk‐II 结构。一般，丝素蛋白在稀溶液中主要以无规线团存在，在一定外界条件下（如冷冻、加热、浓缩、稀释、溶剂处理、改变pH 值、金属离子引入以及施加应力等）都可以诱导其无规线团向更稳定的β折叠构象的改变。而且，在某些盐和酸存在的条件下，使β-折叠向无规线团转变；或者当丝素蛋白浓度增加，超过某一浓度后，也易将无规线团结构转变为β折叠构象，且β-折叠结构含量随着丝素蛋白浓度的增加而迅速增加。而在蚕和蜘蛛腺 体中丝蛋白溶液是以无规线团/α-螺旋构象形式存在，腺体前部的丝蛋白溶液则处于一种向列型液晶态形式。蚕吐丝实际上就是丝蛋白从无规线团/α螺旋构象转变成β折叠构象的蛋白质变性过程。研究认为蚕和蜘蛛在纺丝过程中成功地使用了液晶纺、凝胶纺、超拉伸 纺、干纺、离子纺和自组装纺等多种纺丝方法。 Viney的自组装机理认为，当丝素蛋白溶液在腺体内浓缩时，贮存在丝腺中的球状丝素蛋白分子通过自组装形成线形聚集体，产生各向异性，从而形成超分子液晶。这是一种超分子取向的棒状结构，丝素蛋白分子之间只存在非共价键（盐桥）作用。

一定条件下，丝素蛋白可能在水溶液中组装成纳米粒子。Yamada等用原子力显微镜观测到了丝素蛋白溶液中形成的小岛结构纳米级聚集体。Inoue等人也用原子力显微镜观测到了稀溶液中单个丝素蛋白分子折叠形成的棒状结构，及较高浓度下的线状聚集体结构。 Shi等采用自组装法制备了粒径953-1525nm 的丝素蛋白颗粒，并通过改变聚乙烯醇/丝素/甲醇的体积比，达到调控微粒尺寸和形貌的目的。

王群研究丝素蛋白在药物缓释方面的作用时发现，丝素蛋白自组装制备丝素蛋白微球是当前生物材料研究领域里最具活力的,原因之于人类许多疾病源于蛋白质折叠异常。发现丝素蛋白溶液在特定的条件下通过自组装可形成具有规整结构的微球以及多孔支架材料,并且工艺过程简单,无需接触有毒性的有机溶剂等有害物质。再此基础上其对制得的纳微米微球以及多孔支架在药物缓释方面的应用进行了初步的研究,如以丝素蛋白微球、支架材料为载体,药物的缓释控释。研究表明在相对简单的制备条件下,所制备的丝素蛋白微球具有规整的球形结构、良好的分散性及稳定性,并且通过调节丝蛋白浓度,诱导剂、稳定剂或者分散剂添加量等参数可制备出形貌较好、粒径分布为500~2000 nm且粒径可控的单分散丝素蛋白微球。

2.6 蚕丝蛋白自组装的应用现状

丝素蛋白的氨基酸疏水侧链和亲水侧链规整相间排列，使丝素蛋白具有水溶性与非水溶性，在一定条件下可双向转化的特质，使其可通过自组装行为，将丝素蛋白制备成纤维、粉末、膜及多孔支架等多种形态，以扩大其应用领域。

通过将丝蛋白水解得到的产物：丝胶、丝肽、丝精和丝氨酸等以不同方式添加到护肤品，不但能增强产品的保湿、美白防晒的作用、还能提供皮肤营养、调理皮肤以及温和清洁等功效。将性能良好的丝素蛋白制备成纳米颗粒，并通过有序自组装形成胶体晶体，如果能形成光子带隙，产生结构色，未来可以在化妆品行业有较高的应用价值，可将其运用于指甲油、唇膏的制备中，其产品将具有无毒、无害、色彩亮丽持久的优势。

由于分子自组装与主客体化学、超分子化学密不可分，故分子自组装最重要的是在生物医学领域的应用。蚕丝蛋白优良的细胞相容性、生物安全性、可吸收降解性等生物学特性，使得蚕丝在生物医药材料领域得到了更为广泛的应用。将蚕丝用作手术缝纫线已经有长达数十年的历史。蚕丝中的丝素蛋白纯度高，具有优良的可设计性，迄今为止，丝素蛋白在人造皮肤、人造骨骼、人造角膜、人造血管、人造尿道黏膜等仿生学领域已取得了突破性的进展。郑可等曾在研究中指出，通过氧化的方法引入羧基，氧化丝呈现出自组装成β-折叠的趋势，控制丝素的二级结构,氧化丝素蛋白组织支架为成核透明质酸提供了良好的表面，以及支持从骨髓间充质干细胞成骨。随着对丝蛋白的不断深入研究，国内外研究者愈加地关注起丝素蛋白在药物缓释、抗凝血材料等方面的应用。丝素蛋白多孔支架可通过对其在特定条件下分子组装的控制而形成，制备过程整合了溶液浇铸和蛋白质特定条件下的构象转变。得到的多孔支架材料具有规整的开孔式结构，孔隙间互相贯通，有着较好的力学性能，更为重要的是其结构和性能可以根据不同的应用需要进行适当的调控。制备的多孔支架材料具有很好的可塑性，支架的三维结构完全由浇铸模具决定，因此可以根据不同的需要制备出各种形状的生物材料。除了已观察到的分子自组装现象，更引人注目的是可在分子水平调控生物材料的自组装功能化界面，因此被广泛应用在生物传感器、分子器件、高效催化材料、医用生物材料领域，酶、蛋白质、DNA 等生物分子自组装体系，不仅保持了生物分子独特的生物功能，同时又为信息、电子科学的发展提供了微型化、智能化的材料。

3. 研究的基本内容与计划

1.通过次氯酸钠的氧化将丝氨酸侧链的羟基转化为羧基。

2.评估所获得氧化丝蛋白的电负性和极性特征。

3.基于氧化后丝蛋白溶液的性质改变，从丝蛋白氧化的程度、组装浓度、组装温度等方面对醇诱导下氧化丝蛋白组装过程进行评估。

4. 研究创新点

我国是蚕丝的生产大国，我们应该最大化的利用这一优势，将现有的蚕丝研究成果系统化和实用化，应用到生活的各个领域。虽然，蚕丝蛋白有许多优良的性能，但其仍有许多不足。在丝素蛋白的制备方面，我们要采取多种技术，找到能够大量生产并且尽量减少破坏丝素蛋白本身性质的方法。目前大多数自组装还是停留在大尺度上，因此考虑通过调节丝素蛋白自组装来形成纳米结构，是制备具有纳米结构丝素生物材料的一种方法，丝素蛋白作为天然高分子材料，在分子自组装的研究中扮演重要的角色，基于自组装的丝 素蛋白材料应用的研究，不但可以拓展丝素蛋白的多元化应用，而且会促进新型材料的发展。可以预计，今后对蚕丝的研究也将会在更广泛的范围展开。