1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）
文 献 综 述
1.富马酸概述
富马酸（fumaric acid），又名反丁烯二酸、延胡索酸，最早从延胡索中发现。富马酸分子式为c4h4o4，分子量为116.07，结构如图1所示，与顺丁烯二酸互为几何异构体。常温常压下，富马酸为白色结晶状粉末，有水果酸味，密度1.625 kg/m3，熔点286 ℃，290 ℃会发生分解[1]，加热至300 ℃易失水生成顺酐。富马酸在水中的解离常数如下：pk1=3.02，pk2=4.38，pki=3.70[2]。
2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案
1.拟解决的问题 1.1如何构建富马酸的积累途径 作为中间代谢产物，富马酸参与细胞代谢，一般情况下大肠杆菌几乎不积累富马酸。要想实现富马酸的积累，首先必须构建富马酸的积累途径。从代谢网络分析，至少可以通过二条代谢途径来实现富马酸的积累，一是TCA还原途径，另一个是TCA氧化途径。通过TCA还原途径积累富马酸可以在敲除富马酸还原酶的基础上（阻断富马酸至丁二酸的合成），异源导入富马酸合成过程的关键酶，如米根霉的富马酸酶；通过TCA氧化途 径积累富马酸可以在基因组代谢网络模型预测的基础上寻找关键基因，通过调控关键基 因实现TCA氧化途径中富马酸的积累。 1.2如何提高富马酸的积累 在获得目标靶基因的基础上设计合适的sRNA序列，调控靶基因的表达水平，最终实现富马酸代谢过程各基因表达的合理配置，提高富马酸的产量。 2.拟采用的研究手段 （1）sRNA序列设计及载体构建 所设计的sRNA序列由3部分组成：与目标基因mRNA匹配的10-30 bp长度的序列，来源于大肠杆菌自身的OmpC 转录的MicC Srna 调控因子，T1/TE（图3）。由于与目标基因所匹配的序列较短，可直接将该片段设计至克隆MicC骨架的引物上，以来源于大肠杆菌自身的OmpC转录的MicC Sma调控因子为模板进行PCR扩增，将所涉及的sRNA序列连接至不含RBS位点的载体上。 图3. sRNA半理性设计示意图 （2）基于sRNA介导的基因表达调控 根据基因组规模网络的模拟预测，设计与目标靶基因相匹配的sRNA，导入宿主菌，考察sRNA对靶基因表达调控的影响，进一步优化sRNA的设计。在此基础上，构建组合有两个靶基因的sRNA-sRNA体系，实现同时对宿主菌中多个靶基因表达调控的干扰，实现宿主菌中富马酸的大量积累 3. 拟采取的技术路线 根据本项目的研究内容和研究目标，拟采取的技术路线如图4所示： 图4.技术路线图 |
