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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| （一）课题意义 复合型果蔬酵素发酵制品是以多种新鲜水果或蔬菜作为原材料，经过益生菌发酵而成的富含多种营养物质的功能性发酵产品，其中含有大量氨基酸、矿物质和益生菌代谢产物等都是对人体有益的物质[1]。益生菌在发酵过程中产生的多酚类物质、细菌素、胞外多糖和酶类都属于功效成分[2,3],以使产品具有调节肠胃功能、提高人体免疫力、抑菌和抗氧化的作用。同时，由于乳酸菌或酵母菌等益生菌在发酵过程中产生多种酚类物质[4]，以及产品中含有酸的情况发生变化，使产品具有特殊的风味 复合型果蔬酵素浓浆固态发酵产品融合传统发酵饮料和果蔬汁饮料两大产品的特点，绿色营养，风味独特，成为目前相关产品研究中的新亮点。目前研究主要集中在分析发酵过程中的生物转化、功效酶的活性、营养成分等[5,6]，并对其进行功能验证。 （二）国内外研究概况 关于果蔬酵素发酵的研究在国内外的文献中经常可见。Kim等[7]将柑橘果肉副产品（CFB）和果皮副产品（CPB）以nuruk发酵剂（含曲霉、根霉、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸菌）进行发酵15d，发酵的CFB和CPB中的槲皮素、柚皮素和橙皮素的浓度显著增加（分别增加了130.396和50.757ppm），而橙皮苷和柚皮苷的浓度降低；其抗氧化活性与未发酵的对照相比，增加了约2倍。生物转化后的橙皮苷元如橙皮素和柚皮素比未转化的橙皮苷和柚皮苷具有更强的抗氧化活性。可见，通过发酵使果蔬 中的物质进行了生物转化，明显增强其抗氧化活性。针对不同的果蔬的发酵，筛选其适制性的功能菌株是提高其抗氧化活性的关键，Fessard 等[8,9]通过筛选34个功能菌株以制备具有抗氧化活性的菠萝汁发酵饮料，结果表明菌株Weissellacibaria 64 和Leuconostocmesenteroides 12b能够增加其抗氧化活性。卢冬梅等[10]筛选酵母菌RV171制备火龙果不同种类和部位的发酵液，发现红心火龙果的果皮发酵液的总黄酮和总酚含量最高，总抗氧化能力、还原能力和羟自由基清除能力最强。因此，应根据不同的果蔬原料对发酵菌株进行筛选，以更有效地提高产品的抗氧化作用。果蔬发酵汁中的黄酮、生物碱、多糖、皂苷、萜类和多酚等物质还具有辅助降血脂、降血糖和抗疲劳的功效[11,12]。Zhang等[13]研究表明植物乳杆菌和黄色微杆菌发酵的柿果液对小肠中α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果比非发酵组高2.06-4.73倍，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，具有降血糖的功能[14]。以枯草芽孢杆菌发酵的南瓜提取物可以抑制高脂饮食小鼠的体重增加，并且降低脂肪组织、肝酶和血浆脂质的水平，具有控制肥胖和脂肪肝的功能[15]。 （三）应用前景 |
我国水果和蔬菜资源十分丰富，但具有时令性，存在保藏加工性较差，鲜销状况比较严峻的问题，导致部分果蔬原料的浪费。通过有益菌对其进行发酵，不但解决了资源浪费的问题，而且发酵制品的营养价值和益生功效得到了提高，改善了风味，延长了产品的保质期，并且可提高产品的安全性等。
因此近年来发酵果蔬制品已成为一个新的经济增长点。发酵果蔬汁在欧美日韩等地区流行甚广，如日本的发酵蔬菜饮料产品“蔬菜的战士”含有西红柿、南瓜、大蒜、甘薯等8种富含胡萝卜素的蔬菜，具有独特风味且营养丰富，颇受市场欢迎。在英国市场上，有各种水果风味的“Froot”发酵饮料。在我国近年来各类果醋、枸杞汁发酵饮料、芦荟汁酸乳饮料、艾酵客发酵果蔬汁等产品开始流行，目前也已有针对不同果蔬原料，如南瓜、花椰菜、西瓜、苹果、红枣、甜瓜、苦瓜、芹菜、番茄、荔枝、火龙果等的发酵产品的研发，取得了初步的进展[16]。南昌大学、江西江中制药有限责任公司等单位联合创制了果蔬发酵专用益生菌发酵剂，采用新工艺生产的 13 类发酵果蔬系列产品受到国内外消费者的一致好评[17]。
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2. 研究的基本内容和问题
| （一）研究目标 以多种新鲜果蔬为原材料，利用以乳酸菌为主的益生菌进行固态发酵，分析发酵程中的生物转化、功效酶的活性、营养成分等，并对其进行功能验证。
（二）研究内容 1.多种果蔬混合固态发酵 2.观察发酵过程中pH变化情况 3.测定和分析发酵过程中乳酸菌落数量变化情况 4.测定和分析发酵过程中总菌落数变化情况 5.测定和分析总酸变化情况 6.分析样品中有机酸变化情况 7.测定和分析发酵前后花青素含量变化情况 8.测定和分析发酵前后总酚变化情况 9.测定和分析发酵前后总黄酮变化情况 10.测定和分析发酵过程中亚硝酸盐的变化情况 11.测定和分析发酵前后SOD值变化情况 12.对样品进行感官评定 13.测定和分析发酵过程中还原糖变化情况
（三）拟解决的关键问题 1.发酵过程中各种菌落的生长变化情况 2.发酵前后各个样品内含有功能因子的变化 3.对样品发酵后的口感进行评定 |
3. 研究的方法与方案
| 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 （一）研究方法 1.复合型果蔬酵素发酵过程中乳酸菌落数和总菌落数的变化情况：采用传统的稀释涂布平板法，结合简单的生理生化鉴定以及在显微镜下观察菌落形态。 2.发酵过程中总酸的变化情况：采用酸碱滴定法进行测量 3.发酵过程中各个功能因子的变化情况 （二）技术路线 处理样品，接种发酵
放入培养箱连续培养3天，每隔12h取样测量
继续置于培养箱中培养12d 置于常温条件下每隔3d取样测量,持续培养12d
（三）实验方案 1.样品运用流动水除去表面泥沙，运用纯水清洗，之后切成小块，采用巴氏杀菌的方式对样品进行杀菌（水浴锅85 ℃），杀菌15 min后冷却至室温。根据不同发酵剂的用量说明添加发酵剂，封口置于培养箱中培养。 2.pH进行检测拟采用15d制, 发酵前期每12h，24h，36h，48h，60h，72h测一次，之后每隔三天测一次，使用实验室pH计进行测量。 3.测量还原糖含量：采用3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS）测定水果饮料中发酵过程中还原糖含量。配置1 g/L葡萄糖标准液，依次取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL标准液和0.2 mL待测样品于25mL具塞试管中，加入蒸馏水补足至1.0 mL，各加入2.0 mL DNS试剂，混匀，沸水浴5 min后取出试管冷却至室温，分别用蒸馏水定容至25 mL，摇匀，以蒸馏水反应管为空白参比，于540 nm处测定吸光值。 4. 总酸含量测定：取一定量的样品进行稀释，置于烧杯中，0.2ml，1%的酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定,(如样品酸度较低，可用0.01mol/L和0.05mol/L氢氧化钠标准) 滴定至微红色，30秒不褪色，记录消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积的数值，计算得出总酸含量。 5.总多酚含量测定：取0.3ml样品于10ml的离心管中，（标准曲线相似）再加入0.05ml 2mol/L福林酚试剂以及0.5ml 20%碳酸钠，混合。在室温下反应30min后，使用紫外分光光度计在765nm处进行加成稀释检验。结果以每1 L样品中没食子酸当量毫克(mg GAE/L)表示。 6.亚硝酸盐测定：准确称取5g试样匀浆，添加12.5ml硼砂溶液搅拌均匀，然后用大约300ml、70℃左右的水转移到500ml容量瓶中，将其放在沸水浴中水浴15min，然后将其放在冷水浴中冷却冷却至室温。 将上述提取液先加入5ml亚铁氰化钾溶液，摇匀，然后加入5ml乙酸锌溶液，使蛋白质沉淀，定容至刻度，摇匀，放置30min以除去上层脂肪，将上清液用滤纸过滤，废弃初滤滤液30ml，剩余滤液备用。 用移液管吸取40.0 ml滤液于50 ml具塞比色管中，另吸取0.00 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.60 ml、0.80mL、1.00ml、1.50 ml、2.00ml、2.50 ml亚硝酸钠标准使用液5.0 μg/mL（相当于0.0 μｇ、1.0 μｇ、2.0 μｇ、3.0 μｇ、4.0 μｇ、5.0 μｇ、7.5 μｇ、10.0 μｇ、12.5 μｇ亚硝酸钠），分别置于50 ml的具塞比色管中。分别在标准管和试样管中加入2 ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3 min～5 min 后各加入1ml盐酸萘乙二胺溶液，然后加水至刻度，混匀，静置15 min，用2 cm 比色杯，以零管调节零点，于波长 538 nm 处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时测定样品中亚硝酸盐浓度。 7.总黄酮的含量测定：0min时，在1ml样品中加入0.3 mL 5%的亚硝酸钠；5分钟后，加入0.3 mL的10%氯化铝；第6分钟，加入2ml 1mol/L氢氧化钠溶液； 加入2.4 mL游离水稀释后混合。吸光度采用aHitachi U-1900分光光度计在510nm处测定采用a( )-儿茶素(Sigma)标准曲线测定avonoids含量，吸光度用儿茶素当量(mg CE/L)表示。 8.花青素的含量测定：加入0.025mol/L氯化钾(pH 1.0)和0.4mol/L醋酸钠(pH 4.5)缓冲溶液，按适当的稀释比(1份样品和4份缓冲液)稀释果汁。样品混合后置于暗处30分钟，吸光度由日立U-1900分光光度计在520和700 nm处测定，结果采用以下公式计算，其中520为520nm处的吸光度，700为700nm处的吸光度，pH分别为1.0和4.5。
（四）可行性分析 目前对果蔬酵素浓浆发酵中利用的益生菌已经有了广泛而深入的研究,本课题中直接采用商品发酵剂进行接种，菌株质量稳定。且所在食品微生物研究室在微生物培养的设备和试剂种类都很齐全，也有较强的理论和实验操作技术基础。其余的如测量pH值等，都是比较基础的实验操作，故本课题具有较高的操作可行性。
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4. 研究创新点
首先本课题采用复合果蔬作为原料，和传统发酵研究中采用单一原料的实验不同，复合样品中含有多种水果，不同的搭配会使产品口感更加丰富，其中含有的功能因子和化学成分更复杂，风味更独特，具有一定的研究和分析价值。
其次，本课题采用固态发酵，与传统液态发酵不同，发酵初期和过程中还有很多有待研究分析的内容，可以为酵素产品提供新的选择。
5. 研究计划与进展
1. 研究计划
课题拟从2018年11月开始到2019年4月完成。
复合果蔬浓浆进行为期15天一个周期的发酵预实验，同时测量发酵过程中各个指标的变化，寻找合适的配比。（1个月）
