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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题的意义
近年来，微胶囊化成为在食品生产，储存以及开发新的益生菌食品载体中维持细胞活力的重要技术。大多数益生菌直接口服导致大量活力丧失，这归因于胃肠中存在的高酸和胆汁盐浓度。通过微囊化减少了通过胃肠道期间的细胞死亡，而且可以控制这些细胞在肠道中的释放。微囊化技术大部分是将细菌移动到聚合物基质中，以此来排除外界不利因素影响。本课题采用四种包封方式对比，包括明胶-阿拉伯树胶，明胶-壳聚糖，明胶-魔芋葡甘聚糖，阿拉伯树胶-壳聚糖，四组材料通过乳化方式包埋，观察微胶囊在肠道消化中对菌体的保护作用以及在储存中的稳定性。
国内外研究进展
微囊化的研究突破主要来自于材料以及微囊化方式的选择，其次再是对材料比例以及微囊化环境的优化。
微胶囊材料
目前，微胶囊材料主要分为蛋白质和多糖两类，表一举例介绍各类材质。
表一：微囊化材料分类及举例
| 分类 | 举例 |
| 蛋白质 | 乳清蛋白，酪蛋白，明胶，谷蛋白，多肽，大豆蛋白，植物蛋白，乳清蛋白，玉米醇溶蛋白 |
| 单糖 | 果糖，半乳糖，葡萄糖，麦芽糖，蔗糖 |
| 碳水化合物/树胶 | 壳聚糖，玉米糖浆固体，环糊精，糊精，干葡萄糖浆，麦芽糖糊精，改性淀粉，淀粉，琼脂，海藻酸盐，角叉菜胶，阿拉伯树胶，阿拉伯树胶，果胶 |
| 纤维素 | 羧甲基纤维素，乙酸邻苯二甲酸丁酸纤维素，醋酸邻苯二甲酸纤维素，乙基纤维素，甲基纤维素 |
| 脂类 | 食用脂肪和油，分馏脂肪，硬化脂肪，蜂蜡 |
| 乳化剂 | 甘油单酯，甘油二酯，卵磷脂，脂质体，食品级表面活性剂 |
微囊化的方式
益生菌微囊化的方式主要分为三大类，包括挤压法，乳化法，喷雾干燥法，如表二介绍了几种方法的优缺点以及不同方法常用材料。
表二：微胶囊方法以及特性
| 方法名称 | 常用材料 | 优点 | 缺点 |
| 挤压法 | 海藻酸钠，黄原胶，乳清蛋白 | 操作简单，在实验室中表现良好环境，成本更低，细胞活力更高 | 不可能微粒小于500毫米；通过传统的逐滴方法，过程持续时间和扩大规模的难度 |
| 乳化法 | 海藻酸钠，壳聚糖，明胶，酪蛋白酸盐，芝麻油 | 创造的可能性小于100毫米的胶囊，最终尺寸范围在25mm和2mm之间不等 | 产量较少；废物不易处理；相分离损坏胶囊;生产的胶囊的高尺寸变化 |
| 喷雾干燥法 | 海藻酸钠和角叉菜胶，淀粉，阿拉伯胶，明胶，乳清、蛋白质，脱脂牛奶 | 主要优点是该工艺成本低，生产率高，再现性高
| 缺点是高温封装降低益生菌的生存能力 |
微囊化环境优化
凝聚过程的优化主要是从表面电荷密度（ζ电位）和浊度出发，这两参数也就是pH和聚合物比的函数。不同环境对微囊化过程有显着影响，包括材料特性，如生物聚合物分子重量，总生物聚合物浓度，生物聚合物混合重量比率，生物聚合物电荷密度/生物聚合物的灵活性以及工艺参数如pH，压力/搅拌，温度和离子强度等。所以微胶囊环境的优化也是一个很重要且繁杂的工作。
应用前景
微囊化技术目前广泛应用于医药化工，食品加工和农业生物技术等领域。但益生菌微囊化技术要解决的核心问题是提高益生菌的抗逆性。如何确保一定数量的活菌能够进入宿主肠道，并且能够抵御宿主机体内高胃酸和胆盐等不利环境，对于益生菌发挥健康功效是十分必要的。国内外已有众多学者在利用微囊化技术提高益生菌的抗逆性方面做了大量研究工作。本研究的微胶囊主要用于食品行业的增强菌体的抗逆性。
牛奶的产品
牛奶衍生物代表了最广泛的食品类别，它是市售产品中益生菌食物的最丰富来源。益生菌已被纳入更广泛的乳制品，包括酸奶，奶酪，冰淇淋，乳制品甜点，婴儿配为许多因素，如奶酪中的凝胶结构，高脂肪含量处理过程中牛奶支持细菌的缓冲性能。有害因素包括胃肠道条件。然而，这种保护作用可能不足以维持益生菌到达发挥作用的地方。因此通过微胶囊的包封作用，可以更好地使菌体抵抗胃肠道低PH条件。
烘焙类产品
益生菌微胶囊添加于烘焙类产品主要有三种方法i）在产品表面上的应用，ii）直接在面团，ⅲ）在所使用的乳膏音响糕点的灌装。但直接加入益生菌，其容易受烘焙条件以及后期储存条件影响，最后在使用前益生菌数量很少，所以应用微胶囊可以在制作以及后期储存阶段起到很大的保护作用。
水果蔬菜的产品
开发以水果和蔬菜为基础的益生菌食品，与低价产品需求增长密切相关。其不含动物衍生物和牛奶的胆固醇，被认为是健康和清爽的食物。高含量的维生素，矿物盐等使这些产品成为添加益生菌理想的基质。
肉类的产品
随着人们对功能性食品消费的兴趣增加，其健康也与肉类产品有关。目前许多研究都都侧重减少脂肪，氯化钠，以及添加剂含量。但从另一方面看，可利用肉制品携带益生菌。目前已有报道在香肠以及发酵肉里面分离出益生菌。丰富的益生菌的肉类产品也被用作其用途比如起保护性作用达到抗菌效果。然而，微胶囊可以确保益生菌高活力。在制造发酵和干燥香肠等中起大作用。后期对肉质品的储存也起到保护作用。
参考文献：
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2. 研究的基本内容和问题
研究的目标
本课题的研究目标是从材料，微胶囊方法及条件的探索来寻找新型的益生菌包埋的方式，后期主要测定微胶囊的储存稳定性以及胃肠道模拟消化效果来评价微胶囊的对菌体的保护作用。
研究内容
3. 研究的方法与方案
研究方法
1 菌体培养的活化
将-20oC的L. plantarum 70810,L.helveticus L2-R-5,L.bulgaricusLB-WG三种菌按照5%接种量于10ml MRS肉汤在37oC下培养48小时进行第一次活化，将得到的培养物转移至于200ml MRS肉汤在37oC下培养12-16小时。通过在5000g，10min离心收集菌体，用10mL生理盐水洗涤两次。后将菌体重新悬浮于10mL生理盐水中，储存于4oC。
2 聚合物的准备
分别制备四种壁材料溶液明胶（GE）25 g/L，阿拉伯树胶（GA）50g/L，壳聚糖（CHI）10g/L，魔芋葡甘聚糖（KGM）50g/L，乳化剂-食用油（含0.2%吐温80），益生元-低聚果糖（FOS）30 g/L。材料溶于蒸馏水中并在121℃下高压灭菌20分钟，后置于常温中待用。
3 益生菌的微囊化
四种包封方式为明胶-阿拉伯树胶，明胶-壳聚糖，明胶-魔芋葡甘聚糖，阿拉伯树胶-壳聚糖，前者为内核材料，后者为外壳材料包封方法如下：
2ml内核材料，2ml 低聚果糖与2mL浓缩的细菌悬浮液混合，在恒温水浴摇床50 oC，200rmp混合20分钟，加入2mL外壳材料，34ml含0.2％Tween-80的食用油乳化，继续摇床30min，后置于4oC过夜固定微胶囊。去除上层油相，1000rmp，10min收集并用生理盐水洗涤两次。最后的微胶囊储存在生理盐水中
4 包封率计算
将微胶囊（1ml）收集在管中，其中含有9mLPBS（0.1M），pH7.4，温度为37℃。通过涡旋冲击30s，然后5000rmp 10min离心均质，至菌体全部释放出来。后对菌体进行梯度稀释，后在MRS固体培养基上培养48h，37oC。包封率按如下公式计算：
EE (%) =(N/N0) 100
其中N是微囊化后的细胞对数，N0是微囊化前的细胞对数。
5 显微镜观察
将不同种方式包封好的微胶囊在显微镜初步观察，评估微胶囊的大小形态以及均匀程度。
6 储存稳定性分析
将微胶囊分装在牛奶，4℃和常温下4周; 每周，测量不同温度下微胶囊的活菌数量，评估其储存稳定性。
7 粒度分布
将微胶囊扩散于蒸馏水中，通过激光衍射测量粒度分布，使用1.3326作为微胶囊的折射率。
8胃肠道的模拟消化
制备模拟胃液（SGJ）
| 试剂 | 含量 | g/100ml |
| 胃蛋白酶 | 0.27g/L (250U/mL) | 0.027 |
| 胃粘液素 | 1.5g/L | 0.15 |
| KCl | 6.9 mmol/L | 0.0514 |
| KH2PO4 | 0.9 mmol/L | 0.0122 |
| NaHCO3 | 25 mmol/L | 0.2100 |
| NaCl | 47.2 mmol/L | 0.2758 |
| MgCl2(H2O)6 | 0.1 mmol/L | 0.0020 |
| (NH4)2CO3 | 0.5 mmol/L | 0.0079 |
| 1mol/L 盐酸pH 调至1.6，于37℃水浴锅20min后备用 | ||
| 加酶后，于37℃水浴20min后备用 |
制备模拟肠液（SIJ）
| 试剂 | 含量 | g/100ml |
| 胰液素 | 200U/mL (5.62g/L) | 0.562 |
| 胆盐 | 8.17g/L | 0.817 |
| KCl | 6.8 mmol/L | 0.0506 |
| KH2PO4 | 0.8 mmol/L | 0.0109 |
| NaHCO3 | 85 mmol/L | 0.7140 |
| NaCl | 38.4 mmol/L | 0.2244 |
| MgCl2(H2O)6 | 0.33 mmol/L | 0.0067 |
| (NH4)2CO3 | - | 0 |
| 1mol/L的氢氧化钠pH 调至7，于37℃水浴锅20min后备用 | ||
| 加酶后，于37℃水浴20min后备用 |
胃消化1ml微胶囊加4ml胃消化液，后每半小时定时取样，样品按之前包封率计算方式测定剩余菌体含量，2h胃消化结束后调节溶液PH为中性，后加4ml肠消化液，半小时定时取样，后测菌体含量。
技术路线
实验方案的可行性分析
1 经过多方调查以及文献的阅读，制定了多种方案。通过预实验筛选，最终确定这四种方案，所以实验的可行性很大。
2 实验室拥有完备的器材以及充足的实验经费可供方案的开展
3 本实验最终确定的方案以及测评实验都是比较简单的微生物操作实验，难度系数较小，所以实验操作容易完成，仅仅是时间稍长的问题。
4. 研究创新点
特色或创新之处
1 讨论了不同材料相互间组合对益生菌包封效果比较
2 每种基质都对益生菌的保护可行性提出了潜在的新挑战。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2018.09-2018.11 文献查阅，课题方案的确定
2018.11-2018.12 预实验，确定可行性方案
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